【目的】克隆Tri101并通过原核表达获得纯化蛋白,通过免疫SPF大白兔获得高效价、高灵敏度的多克隆抗体,为Tri101蛋白及转Tri101作物的检测提供抗体基础【。方法】以禾谷镰刀菌(Fusarium graminearium)F3210为材料,PCR法获得Tri101并连接至表达载体pET29a(+),将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后利用IPTG进行诱导表达。利用纯化表达产物制备多克隆抗体。【结果】SDS-PAGE分析结果表明,Tri101在大肠杆菌BL21(DE3)中得到表达,重组蛋白大小为50 kD左右,以包涵体形式存在。利用HisTrap亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱...

[目的]制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。[方法]构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。[结果]成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。[结论]成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。

【目的】制备抗果蝇组蛋白乙酰转移酶Atac2的单克隆抗体,为进一步研究Atac2基因的功能提供重要的试验工具。【方法】PCR扩增果蝇Atac2蛋白N端前26个氨基酸的编码基因,构建GST-Atac2融合蛋白表达载体pGEX-Atac2。转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),进行诱导表达,通过GST亲和层析法纯化GST-Atac2融合蛋白。以GST-Atac2为抗原免疫8周龄的Balb/c小鼠,取脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法检测阳性孔,经有限稀释法亚克隆,筛选单克隆杂交瘤细胞株,检测抗体的特异性、效价和亚型,并检测其亲和常数。【结果】PCR扩增获得了目的片段。成功...

实验进行了青鱼(Mylopharyngodon piceus)Dazl基因的原核表达,兔抗青鱼源Dazl多克隆抗体的制备及抗体的特异性验证。首先将青鱼Dazl基因的编码区利用重组表达引物从pCS2-MpDazl质粒中扩增出来,经酶切后连接到pET-28a载体中,构建pET-28a-MpDazl重组表达载体。然后将pET-28a-MpDazl重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,利用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得分子量为27 kD的Dazl重组蛋白。将纯化的Dazl重组蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,抗体的效价和特异性通过ELISA法和Western blot检测。结果:成功构建重组表达载体pET-28a-MpDazl;以0.5 mmol/L IPTG在37℃条件下诱导4 h可获得高效表达的Dazl重组蛋白;制备的兔抗青鱼Dazl多克隆抗体能够特异性识别原核表达Dazl蛋白、青鱼卵巢的内源Dazl蛋白以及细胞中过表达的Dazl蛋白,并证实了青鱼Dazl蛋白在性腺中表达的特异性。

抗苗勒氏管激素(anti-mullerian hormone,AMH),也称苗勒氏管抑制物质(mullerianin hibiting substance,MIS),为肽类生长因子,属于TGF-β生长和分化因子家族。为研究AMH对奥利亚罗非鱼性腺发育的作用,应用DNAstar软件分析罗非鱼AMH基因的抗原性,选择抗原性较强的22～243氨基酸作为目的片段构建了AMH的原核表达载体并进行融合表达。首先利用RT-PCR方法从性腺中扩增出长约663bp的目的序列AMH基因,克隆至T载体中,经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将此片段克隆到表达载体pGEX-5x-1中构建重组表达质粒pGEX-A...

为构建小鼠BMP3蛋白原核表达载体,纯化BMP3蛋白,制备并鉴定BMP3蛋白小鼠多克隆抗体,以及对BMP3进行系统进化关系研究。采用RT-PCR方法从小鼠肝脏中克隆获得BMP3蛋白的表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得BMP3蛋白,免疫小鼠制备BMP3蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度达1∶3 200倍,Western Blotting证实抗血清具有很好的特异性。通过DNAMAN软件对BMP3序列同源性分析发现其C-端在不同动物间存在较高同源性;MEGA软件对BMP3序列的系统发生分析证实BMP3在动物间具有明显的进化趋势。为BMP3蛋白调控骨代谢及与肿瘤的关...

【目的】制备高特异性、高效价的乙酰/丙二酸单酰转移酶(MAT)多克隆抗体,为研究山羊MAT在脂肪酸代谢中的功能奠定基础。【方法】采用PCR方法扩增奶山羊的MAT基因,将其亚克隆到pET32a(+)载体得到pET32a(+)-MAT原核表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的MAT蛋白经复性后进行活性检测。采用皮下免疫法将纯化的MAT蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测血清多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR扩增得到981bp的MAT基因编码区;成功构建了pET32a(+)-MAT原核表达载...

为研究梅花鹿Thymosin beta 10基因(Tβ10)在鹿茸快速生长过程中的作用,利用Gateway技术构建梅花鹿Tβ10基因的原核表达载体—pDEST17-Tβ10并诱导表达,对融合蛋白进行功能检测及多克隆抗体制备。结果表明:1)获得了190bp Tβ10基因开放阅读框序列,并获得重组表达载体pDEST17-Tβ10。2)pDEST17-Tβ10在宿主BL21-SI中诱导表达条件为0.3mol/L NaCL诱导2h,获得产物的最终浓度为0.50mg/mL。3)制备的Tβ10蛋白多克隆抗体血清效价在105之上,该抗体可以特异性结合天然和原核表达的Tβ10蛋白。4)离体检测发现,Tβ10融合蛋白一方面可以促进人脐静脉内皮细胞增殖,另一方面可以抑制鹿茸前成软骨区细胞的增殖。综上所述,本研究获得了具有生物活性的Tβ10融合蛋白,并制备了高度特异性的梅花鹿Tβ10蛋白多克隆抗体,为深入研究Tβ10基因的生物学功能奠定了基础。

从猪外周血淋巴细胞中克隆猪CD40L基因,构建表达载体pET-CD40L,转化大肠杆菌BL21(DE),表达获得相对分子质量约为48×103的重组融合蛋白。以纯化的重组蛋白免疫新西兰兔,获得抗猪CD40L的特异性抗体。间接ELISA检测到多克隆抗体效价达到1:12 800,Western-blot检测结果表明,得到的抗体既可与纯化的CD40L蛋白特异性结合,又可与表达猪CD40L的重组杆状病毒特异性结合。

【目的】克隆猪Jiv蛋白核心区的2 112bp的基因片段,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达和纯化,制备抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。【方法】利用RT-PCR方法,从猪脾脏组织RNA中扩增得到猪Jiv基因,将其克隆到pMD19-T载体并测序,以此为基础构建原核表达载体pET32a-Jiv,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导表达,获得大量包涵体形式的猪Jiv融合蛋白。通过镍离子螯合层析柱对表达的目的蛋白进行纯化,对纯化后的包涵体蛋白进行透析复性,以每只新西兰白兔400μg蛋白的初次免疫剂量和500μg蛋白的加强免疫剂量进行免疫,共免疫5次,采集血清,采用间接E...

【目的】已有研究获得鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白(oligoadenylate synthase-like protein,OASL)基因全长,并且证明其可以抑制鸭坦布苏病毒复制。因此在通过原核表达和多克隆抗体制备技术获得带有GST标签的鸭寡腺苷酸合成酶样融合蛋白和该融合蛋白的特异性抗体,为进一步明确鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白抑制病毒复制分子机制提供物质基础。【方法】根据前期研究已经获得的鸭OASL基因开放阅读框(open reading frame,ORF)序列设计全长扩增引物pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R。利用动物组织总RNA提取试剂盒提取健康樱桃谷鸭幼鸭脾脏总RNA;通过RT-PCR,利用随机引物和M-MLV反转录酶扩增获得鸭脾脏cDNA,以cDNA为模板,利用设计合成的pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R引物进行PCR扩增,扩增后的产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,检测后将片段大小与目的条带大小相同的PCR产物切胶纯化,纯化后的产物克隆到pEASY-T1载体,挑取单克隆菌落送基因公司测序,测序验证正确的PCR纯化产物通过限制性内切酶Bam H I和Xho I酶切连接至带GST标签的原核表达载体pGEX-4t-1。重组质粒转化到大肠杆菌BL21(PLYSS)~(TM),经终浓度为0.5 mmol·L~(-1)的IPTG诱导表达4 h后检测该融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE和Western-blotting分析融合蛋白的表达。利用GST柱亲和纯化上清中的可溶性融合蛋白,经20 mmol·L~(-1) Tris-HCL和0.10 mol·L~(-1)NaCL溶液透析后获取纯化的融合蛋白,采用SDS-PAGE分析纯化的融合蛋白。采用皮下多点注射方法免疫新西兰白兔,经3次免疫后制备多克隆抗血清,采用SDS-PAGE和间接免疫荧光检测抗体的纯度和效价。【结果】克隆测序结果表明,设计合成的鸭OASL基因全长扩增引物pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R能够从樱桃谷鸭脾脏中获得鸭OASL基因ORF序列,并且序列组成与前期研究结果一致。被扩增的序列经酶切后,鸭OASL基因能够与pGEX-4t-1载体成功连接,IPTG诱导后可以在大肠杆菌BL21(PLYSS)TM中表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting分析显示,融合蛋白大小约为84 kD,主要以可溶性蛋白形式表达,在包涵体中也有少量表达。经GST亲和层析纯化上清中的可溶性鸭OASL融合蛋白,得到0.5 mmol·L~(-1)纯度抗原蛋白。经3轮免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,纯化后ELISA结果显示鸭OASL蛋白抗体具有较好的灵敏度,最高效价为1:512 000,SDS-PAGE结果显示抗体大小为55 kD,与ORF理论值相同,且抗体纯度为90%以上。【结论】设计合成的引物能够成功地获得鸭脾脏OASL基因ORF序列,该ORF能够在原核细胞中成功表达,表达的融合蛋白通过免疫新西兰兔能够获得高纯度和高效价的鸭OASL多克隆抗体,研究成果为后续深入研究鸭OASL蛋白抑制病毒复制分子机制奠定坚实的物质基础。

根据鸡的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)基因序列进行抗原肽分析,选择含大片段抗原表位区约1 500 bp的一段基因(151 515 bp)设计一对特异性引物后进行RT-PCR扩增,并构建pET-32a(+)-PERK重组质粒,将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中.优化诱导表达条件,纯化重组蛋白后免疫兔并制备多克隆抗体.PCR鉴定、酶切鉴定和测序结果表明,pET-32a(+)-PERK重组质粒构建成功.SDS-PAGE电泳鉴定结果表明,重组蛋白在1.0 mmol·L-1IPTG、25℃下诱导9 h时的

【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白(tropomyosin,Tm)能与水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因(Tm),将其在原核细胞中进行表达,纯化Tm蛋白,免疫大白兔并制备其多克隆抗体,为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框(open reading frame,ORF)。提取灰飞虱总RNA,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF,连接至pMD-18T载体后进行测序...

为深入研究鱼类干细胞多能性转录因子Nanog的功能,本实验进行了团头鲂Nanog基因的原核表达和多克隆抗体的制备。首先,从团头鲂卵巢克隆出Nanog基因的编码区,将其连接到p ET32a载体上构建原核表达载体。接着将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得预期大小的Nanog重组蛋白,并获得大量蛋白以制备抗体。最后通过ELISA检测抗体的效价和采用Western blot技术检测Nanog抗体的特异性。结果显示,在37°C,0.5 mm

【目的】构建溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核表达载体,优化OmpK蛋白的诱导表达条件,制备OmpK蛋白小鼠多克隆抗体。【方法】通过PCR扩增获得ompK基因,连接pET-32a质粒构建OmpK-pET32a载体,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达。利用切胶纯化获得OmpK蛋白后,免疫小鼠制备OmpK蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western-Blotting法检测抗血清特异性。通过正交试验,获得OmpK菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。【结果】PCR扩增获得了长816bp的ompK基因;成功构建了OmpK-pET32a载体,其诱导表达产物分子质量为30ku,与预期结果一致。E...