为探究单核细胞增生李斯特菌噬菌体裂解酶的特性及在食品基质中的初步应用，从NCBI获取李斯特菌噬菌体裂解酶lys039基因序列，分析其生物信息学，并在大肠杆菌中表达纯化，研究其裂解活性、对生物被膜的影响以及在牛奶基质中的应用。结果表明：1）裂解酶Lys039由341个氨基酸组成，分子质量为36.4 ku，等电点为9.81，其结构具有酰胺酶活性，对本实验室22株单核细胞增生李斯特菌、2株无害李斯特菌、1株伊氏李斯特菌以及1株威氏李斯特菌具有裂解活性，但是对葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及沙门菌没有显示出裂解活性。2）随着Lys039浓度的升高，裂解活性逐渐增强，最适温度为30℃，最适pH值为6.0。3)Lys039能显著清除单核细胞增生李斯特菌形成的生物被膜，并且可以降低牛奶中单核细胞增生李斯特菌的细菌数量。综上，Lys039温度耐受范围广、耐酸耐碱且裂解谱较宽，可显著清除生物被膜以及初步应用效果良好。本研究为进一步防治及快速检测单核细胞增生李斯特菌提供理论基础。

【目的】构建绵羊肺炎支原体(MO)p74基因重组单核细胞增生李斯特菌(LM)并分析其免疫原性,为研发MO重组活疫苗奠定基础。【方法】采用PCR方法从LM-SB5株基因组中扩增出rli60基因的上、下游同源片段a和b,从质粒pET-32a(+)-p74中扩增出MOp74目的基因片段,利用重叠延伸PCR方法(SOE-PCR)将扩增的3个片段融合成ap74b基因片段,克隆入pMD19-T载体中进行测序鉴定。将ap74b片段从pMD19-T载体上切下亚克隆入pKSV7穿梭载体,构建pKSV7-ap74b重组穿梭质

为克隆、表达单核细胞增生李斯特菌sRNA分子伴侣蛋白hfq基因,并纯化重组蛋白,通过PCR的方法从单核细胞增生李斯特菌基因组DNA中扩增出hfq基因,将扩增产物克隆于pMD18-T载体中,测序验证后,再将hfq基因亚克隆至表达载体pET-32a(+)中,成功构建pET-32a(+)-hfq原核表达载体。然后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,通过IPTG进行诱导表达,对表达蛋白进行可溶性分析,并采用Ni-NTA纯化目的蛋白。结果显示:克隆的hfq基因全长234 bp,编码77个氨基酸,通过SDS-PAGE可以检测到27 kDa的蛋白特异性条带;并从上清中纯化得到了Hfq融合蛋白。为...

为了解非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)分子伴侣蛋白Hfq在LM毒力中发挥的调控作用,在构建LM-Δhfq缺失株的基础上,通过动物攻毒试验检测野毒株LM-SB5与缺失株LM-Δhfq对昆明系小鼠的LD50,肝、脾载菌量及对肝、脾、肾的病理损伤;通过溶血试验检测二者的溶血活性;通过结晶紫染色的方法检测二者的生物被膜生成能力。以分析hfq基因缺失对LM毒力及生物被膜生成的影响。结果显示,与LM-SB5相比,LM-Δhfq对小鼠的LD50升高了6.067倍,毒力显著降低;肝、脾载菌量在第2

单核细胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes是一种重要的食源性人畜共患病原菌,能引起人和多种动物流产、脑膜炎、肠胃炎、败血症、死胎等病症。与传统基于表型的分型方法相比,基因分型方法具有简单快速、分辨率高、敏感性强、重复性好等特点,在李斯特菌病病原菌的监测和溯源中具有重要的应用价值。对单核细胞增生性李斯特菌的3类基因分型方法:酶切技术,DNA测序技术和聚合酶链式反应(PCR)扩增技术进行了概述,从分型成本、样本通量、分辨力、灵敏度、重复性、快捷性和普及性等方面比较了3类基因分型方法的主要特点,重点评述了这些方法在单核细胞增生性李斯特菌暴发监测和溯源上的应用案例,为研究不同基因分型方法在单核细胞增生性李斯特菌暴发诊断、分型检测及感染溯源等方面的应用提供参考。

为探究单核细胞增生性李斯特菌(LM)毒力岛4(LIPI-4)中膜透性酶(EII)对LM毒力基因表达的调控作用，本研究分别构建EII缺失株(LM928ΔEII)、强启动子回补株(CLM928ΔEII-P_(help))和天然启动子回补株(CLM928ΔEII-P_(native)),测定各菌株在体外培养中的生长曲线和在永生化人脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)内的增殖情况；RT-qPCR检测体外培养和HCMEC/D3细胞内各菌株9个关键毒力基因的转录水平。结果显示：1)EII基因缺失株LM928ΔEII构建成功，重组回补质粒pIMK2-EII和pIMK2-EII-P_(native)及回补株CLM928ΔEII-P_(help)和CLM928ΔEII-P_(native)构建成功。2)在体外培养下，EII对LM的生长曲线没有影响。但在侵染HCMEC/D3后，LM928ΔEII在8和12 h的胞内细菌量显著高于LM928(P0.05),而CLM928ΔEII-P_(help)在2、4、6、8、10和12 h均极显著低于野生株(P

【目的】通过对检测食源性致病菌单核细胞增生性李斯特氏菌(LM)的多重PCR体系的优化,建立一种能够在食品样品中应用的四重PCR。【方法】采用热裂解提取菌液和菌落DNA,以16SrRNA、inlAB、iap、hly基因为靶基因设计引物,从影响多重PCR扩增的引物浓度、退火温度进行优化。【结果】通过其它5种同属异种菌即英诺克李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、威尔西李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌及副溶血性弧菌均未扩增出特异性的片段。纯培养物的最低检测限为102CFU/mL,模拟污染的生猪肉检测限不大于0.4CFU/g。【结论】通过菌落获得DNA的多重PCR方法更好,该方法具有敏感、特异、快速及...

为了获得广谱噬菌体裂解酶,根据裂解酶结构及种属特异性,将金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶Ply187CHAP及酶K的SH3b重新合成,并同时将末端引入单核细胞增生性李斯特菌噬菌体裂解酶LysZ5结合结构域,构建具有能够裂解金黄色葡萄球菌及李斯特菌的多功能裂解酶。SDS-PAGE结果表明,融合结构域的重构酶蛋白Ply187KS-Z5大小约为58 kDa,其在金黄色葡萄球菌及李斯特菌平板表面能够形成透明裂解圈。分析对金黄色葡萄球菌及李斯特菌在生肉表面的裂解活性表明,嵌合酶蛋白Ply187-KS能够有效裂解金黄色葡萄

【目的】研究超高压作用对单核细胞增生李斯特氏菌(LM 54004)细胞膜、氧化磷酸化和F0F1-ATP酶的影响。【方法】用原子吸收法测定LM 54004经超高压作用后细胞内金属离子(K+、Mg2+)的泄漏;以亲脂性阳离子四苯基溴化膦([3H]-TPP+)作为放射性探针标记LM 54004细胞膜,测定经超高压作用后细胞膜电位的变化;用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cFSE)为荧光探针测定经超高压作用后细胞内pH的变化;用比色法测定超高压对LM 54004 F0F1-ATP酶活性的影响。【结果】150—300 MPa作用10 min,随着压力的增大LM 54004菌落数显著降低,细胞内K+和Mg2+没有...

为开发噬菌体裂解酶作为一种新型的抗菌剂,用于沙门菌的防控,采用生物信息学及异源表达蛋白的方法,获得鼠伤寒沙门菌噬菌体T139的裂解酶,并验证裂解酶对鼠伤寒沙门菌的裂解活性。通过对鼠伤寒沙门菌噬菌体T139基因组进行分析,发现该基因组全长38 854 bp,平均GC含量为49.10%,不包含tRNA基因。进化树分析表明噬菌体T139属于T7噬菌体属,共预测出43个ORFs,有23个被赋予已知功能。多序列比对及保守结构域分析表明,orf 40基因编码的蛋白(LysT40)包含126个氨基酸残基,具有内肽酶保守结构域,为可能的噬菌体裂解酶。LysT40二级结构中存在大量的螺旋结构(70.63%),使得该蛋白能够保持结构稳定。将orf 40进行异源表达、纯化,经过SDS-PAGE和Western blot分析,在10～15 ku处获得单一目标蛋白条带,纯化的蛋白质量浓度为280μg/mL。LysT40在30 min内对氯仿或EDTA预处理的鼠伤寒沙门菌具有较好的裂解活性,吸光值OD_(600)相比于对照组分别下降0.18和0.31。

【目的】探究单核细胞增生性李斯特氏菌Listeria monocytogenes tatD基因缺失对小鼠Mus musculus毒力和肠道菌群的影响，为tatD在单核细胞增生性李斯特氏菌与宿主互作中的作用及减毒疫苗研究提供参考。【方法】采用Bliss法将亲本菌株(LM10403s)、缺失菌株(LM10403sΔtatD)和互补菌株(LM10403sCΔtatD)口服感染小鼠，确定菌株对小鼠的半数致死量(LD50)。LM10403sΔtatD以1.00×105 CFU口服免疫小鼠观察其免疫保护效果。将40只6周龄雌鼠随机平均分为对照即磷酸缓冲盐溶液组(PBS)、LM10403s组、LM10403sΔtatD组和LM10403sCΔtatD组，PBS组小鼠灌胃200μL无菌PBS，实验组分别灌胃200μL含1.00×106 CFU的菌液。灌胃24 h后剖杀各组小鼠，收集肠道内容物，采用Illumina Hiseq测序技术测定各处理小鼠盲肠样品微生物16S rRNA V3～V4区序列，并比较分析其微生物群落结构、多样性和信号通路富集。【结果】LM10403sΔtatD的LD50为8.11×107 CFU，毒力低于LM10403s。同时LM10403sΔtatD口服免疫小鼠后对单核细胞增生性李斯特氏菌亲本菌株的攻毒能提供80%保护率。Chao1和Observed species指数显示：PBS与LM10403sΔtatD处理组差异不显著，但LM10403s组和LM10403sCΔtatD处理组相比于PBS处理组显著下降(P<0.05)。在门水平上，LM10403sΔtatD处理组的厚壁菌门Firmicutes相对丰度高于LM10403s和LM10403sCΔtatD处理组，而在属水平上，乳杆菌属Lactobacillus相对丰度高于LM10403s和LM10403sCΔtatD处理组。功能预测分析显示：LM10403s处理组在细胞过程、环境信息处理和新陈代谢等信号通路的富集程度高于LM10403sΔtatD处理组。【结论】tatD基因缺失后单核细胞增生性李斯特氏菌的毒力降低，并具有一定的免疫保护效果。tatD基因缺失菌株感染小鼠对肠道菌群失调影响减小，且有益菌增多。图6表1参21

【背景】解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora）是仁果类果树火疫病的病原体，对全球苹果和梨的生产构成严重威胁。随着抗生素耐药菌株的出现，火疫病的防治面临巨大的挑战。【目的】分离一种新的裂解解淀粉欧文氏菌的噬菌体，并分析该噬菌体裂解相关基因的功能，为火疫病的防治提供新的选择。【方法】以解淀粉欧文氏菌Ea102为宿主菌，采用双层平板法从流行火疫病的果园土壤中分离噬菌体。通过噬菌斑和透射电镜观察其形态。用PacBio测序技术测定噬菌体基因组，SPAdes组装序列，RAST注释基因组。通过大肠杆菌原核表达系统分析噬菌体Kuerle的裂解机制。【结果】分离纯化出一株裂解解淀粉欧文氏菌的噬菌体，命名为Kuerle。Kuerle由二十面体衣壳的头部和短尾组成，潜伏期约为50 min，裂解量约为240 pfu/cell。噬菌体基因组全长75 599 bp,GC含量48.0%，末端有393 bp的重复序列，未发现与溶原调控相关的基因。共预测到85个开放阅读框（open reading frame,ORF），其中33个已知功能蛋白中包含一个由3 550 aa组成的巨大病毒颗粒相关的RNA聚合酶（virion-associated RNA polymerase,vRNAP），该vRNAP是Schitoviridae科噬菌体的主要特征之一。病毒粒子和基因结构表明噬菌体Kuerle属于有尾噬菌体类的Schitoviridae科病毒。聚集在DNA晚期表达区的3个裂解相关基因holin、endolysin和spanin组成了“裂解盒”。在大肠杆菌中Kuerle-holin的表达会抑制细胞的生长，而Kuerle-endolysin的表达可裂解细胞。二者共表达时Kuerle-holin会加速Kuerle-endolysin引起的细胞裂解。用叠氮化钠抑制细菌的一般分泌系统（Sec）或Kuerle-endolysin N端信号序列的缺失均会导致endolysin裂解功能丧失。上述结果表明噬菌体Kuerle具有pinholin-SAR endolysin裂解系统。Kuerle-holin(pinholin)使细胞质膜去极化以激活分泌的Kuerle-endolysin(SAR endolysin)降解肽聚糖层。【结论】Kuerle是一株烈性噬菌体并且Kuerle-endolysin抑菌效果显著，为后续火疫病生防试剂的制备提供了理论依据和研究材料。

【目的】分离并纯化出一株裂解性青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)噬菌体,并测定其各项生物学特性,为开发新的抗烟草青枯病制剂提供依据。【方法】取烟草青枯病重病田中健康烟株的根际土壤制成土壤悬浮液,并通过在青枯雷尔氏菌菌液中加入过滤后的土壤悬浮液富集噬菌体,用双层平板法验证噬菌体的存在后挑取单个最大噬菌斑进行反复纯化,直到得到单一清晰的噬菌斑。纯化后的单个噬菌斑加入对数早期的青枯雷尔氏菌菌液中进行增殖培养,将增殖液按常规方法进行噬菌体颗粒浓缩后,取20μL浓缩液用磷钨酸染色并通过电子显微镜观察噬菌体的形态特征;同时将浓缩液进行SDS-PAGE电泳,观察蛋白条带大小和数量;...

为研究耐黏菌素大肠杆菌的噬菌体治疗方法，本研究以耐黏菌素大肠杆菌为宿主菌，采用双层琼脂平板法从山东烟台某养鸡场污水样中分离纯化得到裂解性噬菌体SDYTW1-F1-2-2。通过透射电镜观察，最佳感染复数，一步生长曲线，温度稳定性，酸碱度稳定性等生物学特性测定，并对其进行全基因组测序分析。结果表明：1）噬菌体SDYTW1-F1-2-2噬菌斑呈现透亮，外周无晕圈，形态学观察显示其具有可伸缩性尾鞘。2）生物学特性分析表明，噬菌体最佳感染复数为0.1，潜伏期为50 min，爆发期为40 min，爆发量为（331±9）PFU/cell。在温度4～40℃，pH为4～12的环境下，噬菌体活性较为稳定。3）通过噬菌体全基因组测序及核酸类型鉴定显示，该噬菌体基因组全长为74 752 bp，双链DNA,GC含量42.1%。在噬菌体基因组中共鉴定出121个编码蛋白（CDS），包括结构组成、DNA代谢与复制和包装以及细菌裂解相关的功能基因，发现一个tRNA基因，且未检测到如stx-1等致病性基因和mcr-1等耐药基因相关的基因。综上，噬菌体SDYTW1-F1-2-2裂解谱较宽，具有良好的酸碱性、热稳定性以及安全性。本研究为后续开展针对耐黏菌素大肠杆菌的噬菌体治疗研究提供依据。

为了解载体介导噬菌体入胞及抗胞内寄生菌的最新研究进展，利用文献综述法检索近年载体介导噬菌体入胞的相关文献，从功能发挥、试验技术及应用前景等方面对可应用于介导噬菌体入胞的载体进行整理讨论。结果表明：1)噬菌体作为一类能够感染和裂解细菌的病毒，其天然存在的抗菌特性使其作为抗生素替代物的研究广泛存在，但其靶向胞内寄生菌的基础研究主要集中在国外，国内鲜有报道。2)与游离噬菌体相比，以无机纳米微粒、脂质体等作为载体介导噬菌体入胞，能够防止噬菌体被宿主免疫系统清除和免受细胞内环境影响。3)脂质体因其作为载体可有效提高噬菌体入胞效率及杀菌效率，现已成为研究最广泛的噬菌体入胞载体之一。因此，本文综述近年来国内外关于载体介导噬菌体入胞及抗胞内寄生菌研究进展，详细阐述不同介导噬菌体入胞的载体特性、入胞机制以及如何提高入胞效率等方面的最新研究，并针对目前存在的问题和发展前景进行展望，以期为更有效地利用载体投递系统高效投递噬菌体解决细胞内细菌感染的实际问题提供参考与理论支撑。