用细胞流式、台盼蓝染色、免疫组织化学等方法研究单一高温(40℃1 h)或连续高温(40℃1 h.d-1)3~7 d对乳腺上皮细胞细胞周期、凋亡及热休克蛋白(HSP70)表达的影响。结果表明:40℃1 h单一高温处理乳腺上皮细胞后24 h,G2比例极显著高于对照组(37℃)(P<0.05)。结果提示:高温诱...

【目的】MicroRNA(miRNA)是一类长度约21-23个核苷酸的非编码小RNA分子,本研究旨在分析高温条件下miRNA-24对乳腺上皮细胞生长、凋亡的作用及其初步机制。【方法】体外培养奶牛乳腺上皮细胞,高温(41℃)处理所培养的细胞;应用miRNA基因沉默技术,抑制高温处理过的乳腺上皮细胞中miRNA-24的表达;采用细胞计数法分析细胞增殖情况;Hoechst33342/PI荧光染色、流式细胞术检测miRNA-24对乳腺上皮细胞凋亡的作用,Western blot检测凋亡相关因子表达变化。【结果】抑制miRNA-24的表达,高温条件下的乳腺上皮细胞增殖能力显著增强(P<0.05),凋亡细...

[目的]本试验旨在揭示胆碱对热应激诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡的抑制作用。[方法]奶牛乳腺上皮细胞系(MAC-T细胞)于含10%胎牛血清的DMEM培养基中进行体外培养,将细胞分为对照组、胆碱组(100μmol·L~(-1))、热应激组(42℃,2 h)、热应激+胆碱组。采用CCK-8法分析添加胆碱对MAC-T细胞的药物毒性及细胞增殖活性的影响,采用Western blot分析蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)磷酸化水平及激活转录因子4(ATF-4)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)和Bcl-2关联X(Bax)蛋白表达水平,RT-qPCR检测GRP78、CHOP、ATF-4、Bax、Bcl-2、Caspase-3(胱氨酸蛋白3基因)mRNA水平。[结果]与对照组相比,热应激组MAC-T细胞的相对存活率极显著降低(P<0.01),p-PERK、ATF-4、CHOP、GRP78和Bax蛋白表达量极显著升高(P<0.01),Bcl-2表达量极显著下降(P<0.05),p-PERK、ATF-4、CHOP、GRP78和Bax蛋白表达量均极显著下降(P<0.01),Bcl-2蛋白表达量升高(P

【目的】探究苦参碱对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）增殖、凋亡及抗氧化能力的影响。【方法】利用含0（A组），25（B组），50（C组），75（D组）和100 μg/mL（E组）苦参碱的培养基培养奶牛乳腺上皮细胞。通过四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测BMECs活性，采用流式细胞仪（AnnexinV/PI双染法）检测苦参碱对BMECs凋亡的影响，并检测苦参碱对BMECs抗氧化酶活性及丙二醛（MDA）含量的影响，采用real-time PCR对BMECs中Caspase-3、p53、STAT1和SOCS3

应用乳酸脱氢酶(LDH)活力测定、透射电镜、免疫组化和Caspase-3活性分析等技术,检测转化生长因子β1(TGF-β1)对奶牛乳腺组织细胞活性、凋亡和HSP70蛋白表达的影响。用10 ng.mL-1TGF-β1处理乳腺组织48 h,分别在不同时间点收集组织和培养液检测各指标,以0 h不加TGF-β1作为对照组。结果显示,随TGF-β1作用时间的延长组织细胞活率逐渐降低,24 h和48 h组显著低于对照组(P

[目的]本试验旨在研究黄芪多糖(APS)对H_2O_2诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡、氧化损伤及相关基因、蛋白表达的影响。[方法]体外培养奶牛乳腺上皮细胞并用H_2O_2(600μmol·L~(-1),2 h)诱导建立乳腺上皮细胞氧化应激模型;试验分组:空白对照组、H_2O_2组、H_2O_2+APS组(8 mg·mL~(-1)APS)。[结果]与空白对照组相比,H_2O_2组细胞活力显著下降(P<0.05);与H_2O_2组相比,H_2O_2+APS组的细胞凋亡率和细胞中的活性氧(ROS)含量均显著降低(P<0.05),而超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著升高(P<0.01),Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05),且APS降低了H_2O_2诱导细胞凋亡率。[结论]APS能够提高H_2O_2诱导的奶牛乳腺上皮细胞抗氧化酶活性,并减缓氧化损伤引起的奶牛乳腺上皮细胞凋亡。

【目的】探讨TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡和HSP70蛋白表达的影响。【方法】TGF-β1作用乳腺上皮细胞不同时间,收集细胞及培养液,应用MTT检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡率、比色法检测LDH活性、琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性、Western bolt技术分析HSP70蛋白的表达量。【结果】1、5、10ng·ml-1的TGF-β1均能抑制乳腺上皮细胞的增殖,且随浓度增加抑制作用加大,呈现剂量依赖性,其中10ng·ml-1TGF-β1组与对照组差异显著(P<0.05);10ng·ml-1TGF-β1作用于乳腺上皮细胞,随着作用时间的延长,细胞凋亡率逐渐升高,其中6、12和24...

【目的】通过奶牛乳腺上皮细胞体外培养试验,研究黄花蒿乙醇提取物对乳腺上皮细胞中与共轭亚油酸(CLA)合成相关酶的基因SCD表达的影响,探讨其对乳脂肪合成相关酶ACACA和FASN基因以及与脂肪转运相关酶LPL基因表达的影响,旨在从乳腺层次探明黄花蒿乙醇提取物对乳中CLA合成的部分作用机制。【方法】将采自于健康泌乳中期荷斯坦奶牛的乳腺组织用保温盒带回实验室,在无菌条件选取腺泡较多的深层组织,采用胶原酶消化法获得乳腺上皮细胞,放于37℃,CO2浓度为5%的培养箱中进行原代培养。试验所用的细胞是经过复苏的第二代细胞,待细胞复苏后,以3×104个/mL的密度接种细胞到24孔板中,分别置于37℃的5%CO2培养箱中培养,采用台盼蓝计数法每天进行一次计数,设3个重复,连续7 d,未计数组每2天换液一次,绘制细胞生长曲线。另外,待细胞生长至对数增殖期,更换新鲜培养液,随机分为4组,即培养液中黄花蒿提取物的浓度为0、3.0、6.0、12.0 mg·L-1,提取物作用时间均为48 h,检测不同浓度黄花蒿提取物对与脂肪酸合成相关酶SCD、ACC、FAS、LPL基因表达量的影响。每个处理3个重复。【结果】使用倒置显微镜观察,乳腺上皮细胞形态呈铺路石样;在3×104个/mL的接种密度下,细胞生长曲线呈S型,在1—2d乳腺上皮细胞为潜伏期,3—6d为指数增长期,之后进入平台期,符合一般细胞生长曲线规律,说明培养的乳腺上皮细胞具有正常的增殖能力,可以用于后续的研究;与对照组相比,添加黄花蒿乙醇提取物有增加SCD酶基因表达量的趋势,其中3mg·L-1组显著增加了SCD酶的基因表达量(P0.05);添加黄花蒿乙醇提取物有增加乳腺上皮细胞中ACACA基因表达量的趋势,但与对照组相比差异不显著(P>0.05),且随着添加剂量的增加,有下降趋势;添加黄花蒿乙醇提取物可以增加乳腺上皮细胞中FASN基因表达量,呈剂量依赖型增加,且12mg·L-1组可以显著增加乳腺上皮细胞中FASN基因表达量(P<0.05)。【结论】黄花蒿乙醇提取物可以增加奶牛乳腺上皮细胞中SCD、ACACA和FASN酶基因的表达,有利于调控CLA和乳脂肪的生成。

【目的】为了研究微小RNA let-7a（microRNA let-7a，miR-let-7a）对脂磷壁酸（Lipoteichoic acid，LTA）诱导的炎性奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）的增殖和凋亡的作用。【方法】通过实时荧光定量PCR（Quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）、实时细胞分析仪和流式细胞术检测过表达和抑制表达miR-let-7a在炎性MAC-T中的影响。【结果】qRT-PCR检测结果显示，转染miR-let-7a 模拟物会使炎性MAC-T细胞中miR-let-7a的表达量极显著上调（P<0.001），转染miR-let-7a 抑制剂会使细胞中miR-let-7a的表达量极显著下降（P<0.001）；RTCA结果显示，转染miR-let-7a 模拟物能明显促进MAC-T细胞增殖，转染miR-let-7a 抑制物会使MAC-T细胞的增殖受到抑制；流式细胞术结果显示，转染miR-let-7a 模拟物的MAC-T细胞的凋亡率显著降低（P<0.01）；而转染miR-let-7a 抑制剂则与之相反，MAC-T细胞的凋亡率显著升高（P<0.01）。即过表达miR-let-7a可以促进MAC-T细胞增殖，并降低细胞的凋亡率。而抑制表达miR-let-7a的作用与之相反，抑制表达miR-let-7a使MAC-T细胞的增殖下降，细胞的凋亡率增大。【结论】miR-let-7a是一种抑制炎症调节因子，其过表达可以缓解牛乳腺炎，为阐明奶牛乳腺炎的分子调控机制奠定了基础。

【目的】观察金黄色葡萄球菌能否诱导牛原代乳腺上皮细胞发生凋亡。【方法】先以新鲜牛奶为材料分离培养牛乳腺上皮细胞并鉴定,然后用金黄色葡萄球菌侵染牛乳腺上皮细胞,采用普通光镜和扫描电子显微镜观察金黄色葡萄球菌诱导牛乳腺上皮细胞凋亡的形态学变化;用流式细胞仪(Annexin V/PI双染法)定量检测金黄色葡萄球菌感染对牛乳腺上皮细胞凋亡的诱导作用;RT-PCR检测细胞凋亡通路中关键蛋白caspase 3和caspase 8的变化情况。【结果】从乳汁中分离的细胞经原代培养后,细胞呈典型的铺路石状,细胞表层可产生大小不等的乳滴,RT-PCR法扩增出乳腺上皮细胞的骨架蛋白8特异性条带;免疫荧光细胞染色法结...

【目的】奶牛乳房炎是奶牛养殖业中最为常见,同时也是带来经济损失最为严重的疾病之一,其主要病因是细菌感染。奶牛乳腺的固有免疫是抵抗病原菌入侵的第一道防线。NOD2是机体固有免疫模式识别受体核苷酸结合寡聚域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)蛋白家族中的重要一员,通过识别其特异性配体胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)——一种广泛存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁中的成分,而参与抵抗多种病原菌入侵。奶牛乳腺上皮细胞(bovine

[目的]本试验在已有研究血管紧张素系统(RAS)在乳腺中保护作用的基础上,对该家族的主要成员血管紧张素转换酶2(ACE2)在对抗高精料所致奶牛乳腺氧化应激、炎性损伤及细胞凋亡中的作用及机制进行了探讨。[方法]6头健康的泌乳期荷斯坦奶牛,随机分为对照组[m(精)∶m(粗)=4∶6]和高精料组[m(精)∶m(粗)=6∶4],采用单栏、定时、定量饲喂。饲喂20周后,活体取乳腺组织,进行如下试验:1)测定乳腺组织中氧化应激指标·OH水平及TNOS、SOD活性;2)ELISA法测定炎性指标TNFα、IL-1β和凋亡指标Caspase-3、Bax、Bcl-2;3)Western blot分析乳腺组织中ACE2和ACE蛋白的表达;ELISA法测定AngⅡ和Ang1-7的含量。[结果]高精料长期饲喂,奶牛乳腺组织中·OH自由基水平显著升高(P<0.05),SOD活性降低,TNOS活性降低显著(P<0.05);炎症因子TNF-α和IL-1β水平均显著升高(P<0.05);促凋亡蛋白Caspase-3和Bax水平显著升高(P<0.05),抑制凋亡蛋白Bcl-2水平显著降低(P<0.05);乳腺组织中AngⅡ浓度(P<0.05)和ACE蛋白表达水平极显著升高(P0.05),但Ang1-7浓度显著降低(P<0.05)。[结论]长期饲喂高精料可导致奶牛乳腺自由基激活、炎症因子释放、细胞凋亡,乳腺局部损伤。乳腺局部组织中RAS处于激活状态,2条轴互相拮抗,表现为AngⅡ水平升高,ACE2水平降低。

【目的】采用real-time PCR方法检测体外激素处理对奶牛乳腺上皮细胞FcRn(neonatal Fc receptor,FcRn)mRNA表达的影响。【方法】在乳腺上皮细胞培养液中添加不同浓度胰高血糖素(0.01、0.1和1μmol.L-1)、胰岛素(0.005、0.1和0.5μmol.L-1)、甲状腺素T4(0.01、0.1和1μmol.L-1),体外培养并收集细胞,提取细胞mRNA后,利用real-time PCR检测FcRn mRNA的相对丰度。【结果】在一定添加剂量范围内,随着添加剂量的增加,甲状腺素和胰高血糖素能够显著地促进FcRn mRNA表达量升高(P<0.05),胰岛素...

观察扇贝多肽 (PolypeptidefromChlamysferreri) (PCF)对实验性氧化所致小鼠胸腺细胞凋亡的影响。采用台盼蓝 (TrypanBlue)活细胞拒染法在普通光学显微镜下观察细胞的存活率 ;以四甲基氮唑盐 (MTT)法测定细胞的增殖活性 ;以生化检测 (DNAladder)法观察PCF对细胞DNA片断化的影响 ;用透射电镜观察细胞的超微形态结构变化。台盼蓝染色法证实PCF能增强细胞的活性并与PCF浓度成正比 ;MTT法表明PCF不仅能保护细胞免受损伤 ,而且还能促进细胞的增殖 ,并有PCF依赖性 ;生化检测显示PCF能减少细胞凋亡的DNA片断化数目 ;细胞的超微结构还表...

18只AA肉鸡于 2 2℃饲养。 30日龄时 ,随机分成 3组 ,分别进行 0 ,5和 10h的 4 1℃高温应激处理。用流式细胞仪检测胸腺细胞DNA含量、细胞凋亡率以及细胞caspase 3和Bcl 2的表达。结果 :应激处理 0 ,5和 10h时 ,(1)DNA合成期 (S期 )细胞比例分别是 2 77% ,3 2 8%和 2 31% ;(2 )胸腺细胞凋亡率分别是 3 99% ,11 15 %和3 31% ;(3)caspase 3表达阳性细胞率分别为 14 2 4 % ,2 7 0 1%和 10 84 % ,Bcl 2表达阳性细胞率分别是 2 0 5 9% ,15 13%和...