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[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
林梦娇 陈亚东 刘洋 王磊 张天时 史萌 陈松林
为了探究半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)vstm2a基因响应细菌感染的表达特征和其蛋白功能。本研究采用实时荧光定量(RT-qPCR)检测哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染半滑舌鳎后免疫组织(鳃、肝脏、脾脏、肠道和肾脏)中vstm2a的相对表达特征；构建vstm2a基因原核表达重组质粒，获得重组蛋白，采用牛津杯法、细菌蛋白结合实验和siRNA沉默等，探究vstm2a蛋白在细菌入侵中的功能。结果显示：vstm2a蛋白具有跨膜结构域和Ig结构域，在细胞表面行使功能；相关免疫组织中的vstm2a基因的表达量在哈维氏弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌和无乳链球菌感染半滑舌鳎后6 h、48 h和72 h显著升高；vstm2a重组蛋白与细菌孵育后，经过低速离心与细菌共同沉淀；抑菌实验显示其显著抑制细菌的生长，并且siRNA降低vstm2a基因后，抑制了细胞因子IL-6和IL-10等基因的表达。本研究证明了vstm2a蛋白响应细菌入侵，可以识别和结合细菌，通过抑制细菌生长和激活促炎症细胞因子，对病原菌的侵染起到免疫防御作用，是一种重要的免疫蛋白。本研究有助于解析细菌粘附细胞或鱼体抵抗细菌入侵的机制，为未来的采用分子手段选育抗性品种提供一定的理论基础。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
张志华 冯博 朱腾飞 郝先才 王倩 邵长伟 王洪岩
本研究以重要的海水养殖鱼类半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为研究对象，克隆了其白细胞介素12 (IL-12)的p35a亚基和p40c亚基的基因编码区序列，编码区长度分别为651 bp和984 bp。系统进化树分析显示，半滑舌鳎的p35a和p40c分别与其他鱼类对应的基因聚为一支。氨基酸同源性分析显示，p35a与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)相似性最高，p40c与三棘刺鱼(Gasterosteus aculeatus)相似性最高，分别为52.04%和48.67%。组织表达分析显示，p35a在鳃、脑、心和卵巢中表达量较高，p40c在肝、脾、鳃和心中表达量较高。通过哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染实验，分析了半滑舌鳎p35a、p40c及其相关基因(ifn-γ和il-10)在哈维氏弧菌感染过程中的表达模式，p35a在脾中，48 h表达显著上升(P
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
张梦倩 崔忠凯 陈张帆 徐文腾 陈松林
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)生长具有明显的性别二态性，性成熟雌鱼体重显著高于雄鱼。鱼体肌肉占体重的40%～60%，肌肉生长是生长性状的核心，而myostatin (mstn)基因是肌肉生长发育的负调控因子，对成肌细胞的增殖具有抑制作用。本研究旨在探究肌肉生长发育过程中，mstn基因在半滑舌鳎雌、雄鱼中的时空表达模式及其与雌、雄鱼生长差异的关系。结果显示，在所检测的1龄鱼的9个组织中，mstn在肌肉中的表达量最高。不同发育时期的肌肉组织定量结果显示，1龄和2龄雄鱼中的表达量显著高于雌鱼(P<0.05)，而在选取的其他时期，雌、雄鱼之间的表达量不存在显著差异。原位杂交结果显示，mstn基因的表达位置在肌纤维边缘，即成肌细胞增殖分化的位置。本研究系统研究了肌肉生长发育的负调控因子mstn在半滑舌鳎雌、雄鱼中的时空表达模式，为深入研究半滑舌鳎雌雄生长差异的原因及其机制提供了基础。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
孙衍旭 龚小玲 邵长伟
为探究dnmt3a基因在半滑舌鳎性逆转过程中的调控作用，开发适用于半滑舌鳎的DNA甲基化编辑系统，克隆了半滑舌鳎dnmt3a基因的CDS区序列，并通过生物信息学分析其结构域特点以及进化过程中的保守性，利用qPCR分析了其在半滑舌鳎不同性别中的表达模式，探究了DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-dC处理对dnmt3a基因表达的影响。结果表明，dnmt3a基因全长3063bp，编码1020个氨基酸，包括三个核心结构域（PWWP结构域、ADDz结构域和AdoMet＿MTases超家族），dnmt3a基因结合结构域（PWWP结构域、ADDz结构域）相对保守，催化活性结构域（AdoMet＿MTases超家族）与哺乳动物和爬行动物有较大差异。基因表达模式分析表明，雌性半滑舌鳎性腺组织dnmt3a基因表达量显著高于雄性和伪雄性。5-Aza-dC处理后，dnmt3a基因表达显著升高。本研究表明dnmt3a基因在DNA 甲基化调控半滑舌鳎性别决定与分化过程中发挥重要作用，为阐明半滑舌鳎性逆转机制和实现半滑舌鳎单基因靶向DNA 甲基化编辑提供参考。
[期刊] 水产学报
[作者]
程鹏 陈张帆 徐文腾 王娜 杨倩 巩志宏 崔忠凯 胡元日 陈松林
泛素-蛋白酶体系统作为重要的蛋白质修饰途径参与多个生物学过程，其中泛素结合酶E2作为关键酶可以决定泛素化对靶蛋白的影响。为了探究泛素结合酶E2在半滑舌鳎雌性性腺发育中的作用，本研究克隆了半滑舌鳎Cs-UBE2D4基因的开放阅读框ORF，检测了该基因在不同组织和不同发育阶段性腺中的表达模式；构建了其启动子报告基因载体(pGL3-Cs-UBE2D4)并进行了启动子活性分析。Cs-UBE2D4开放阅读框为360 bp，编码119个氨基酸，含有保守的泛素结合酶E2结构域。荧光定量PCR结果显示，Cs-UBE2D4在雌鱼中的各组织中广泛表达，其中在卵巢和肝脏中表达量较高，而在雄鱼中几乎检测不到表达；在卵巢各发育阶段中，该基因的表达量从90日龄开始上调，6月龄时期达到峰值，之后开始下调，在1.5龄时期表达量最低，在3龄时表达量有所回升，其中6月龄表达量为90日龄表达量的1.97倍(P<0.05)。双荧光素酶活性检测结果显示，Cs-UBE2D4启动子具有较强的转录活性。本研究将为进一步开展Cs-UBE2D4基因对半滑舌鳎卵巢发育和性别调控相关机制的研究提供理论基础。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王凯琳 胡乔木 陈松林
通过对半滑舌鳎（Ｃｙｎｏｇｌｏｓｓｕｓ ｓｅｍｉｌａｅｖｉｓ）进行全基因组及转录组测序，预测了一个半滑舌鳎性别相关基因ＣｓＦＲ２，目前已对该基因进行了克隆和表达分析。为进一步研究ＣｓＦＲ２基因的功能，本研究从蛋白层面入手，构建了原核表达载体ｐ ｅＴ－３２ａ－ＣｓＦＲ２，转化到大肠杆菌ｅ．Ｃｏｌｉ进行诱导表达，用Ｈｉｓ ＴＲａｐ进行蛋白纯化，ｓＤｓ－ｐａｇｅ电泳检测诱导及纯化产物，并将表达纯化的ＣｓＦＲ２蛋白注射１龄半滑舌鳎精巢。由于ＣｓＦＲ２是一个性别相关基因，因此无法通过免疫反应来直接检测其蛋白活性，本研究通过不同时间点取样检测半滑舌鳎其他性别相关基因Ｃｙｐ１９ａ和Ｆｏｘｌ２的表达量变化，来．．．
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王凯琳 胡乔木 陈松林
通过对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)进行全基因组及转录组测序,预测了一个半滑舌鳎性别相关基因CSFR2,目前已对该基因进行了克隆和表达分析。为进一步研究CSFR2基因的功能,本研究从蛋白层面入手,构建了原核表达载体p ET-32a-CSFR2,转化到大肠杆菌E.coli进行诱导表达,用His Trap进行蛋白纯化,SDS-PAGE电泳检测诱导及纯化产物,并将表达纯化的CSFR2蛋白注射1龄半滑舌鳎精巢。由于CSFR2是一个性别相关基因,因此无法通过免疫反应来直接检测其蛋白活性,本研究通过不同时间点取样检测半滑舌鳎其他性别相关基因Cyp19a和Foxl2的表达量变化,来...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王润 刘洋 杨英明 王婧 张婷婷 林梦娇 王磊 陈松林
夏季高温会引起半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的应激甚至造成死亡，是工厂化养殖的重要影响因素之一。为探究高温胁迫对半滑舌鳎肝脏氧化损伤及热应激相关基因的影响，本研究选取半滑舌鳎一个全同胞家系为实验对象，通过连续升温达到高温胁迫条件(35 ℃)后，分别在0、3、6、12和24 h采集肝脏组织，进行HE和TUNEL染色观察细胞损伤情况，测定抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量并检测应激相关基因heat shock protein family A member 1A (hspa1a)、heat shock protein 90 beta family member 1(hsp90b1)和dual specificity phosphatase 1(dusp1)的表达变化。结果显示，急性高温胁迫会造成半滑舌鳎肝脏组织产生明显病理变化并出现细胞凋亡；抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)活性在高温胁迫6 h时显著高于对照组(P<0.05)，谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性在高温胁迫12 h时显著高于对照组(P<0.05)，过氧化氢酶(CAT)活性在高温胁迫0 h时显著高于对照组(P<0.05)，MDA含量在高温胁迫24 h时显著高于对照组(P<0.05)；热休克蛋白hspa1a和hsp90b1分别在高温胁迫0和3 h时显著上调表达，热应激相关基因dusp1在高温胁迫3 h时显著上调表达。综上所述，急性高温胁迫下，半滑舌鳎肝脏发生氧化应激，短期内机体可调动抗氧化系统加速清除活性氧，并激活热应激相关基因表达。该研究为解析半滑舌鳎对高温胁迫的响应机制、预防夏季高温大规模死亡的发生以及开展耐高温良种的选育等提供参考。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
马骞 庄志猛 柳淑芳 唐启升
Dorsalin-1是骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)家族成员,在调控脊椎动物神经系统的发育中具有重要作用。目前,国内外有关脊椎动物Dorsalin-1的研究报道十分有限。本研究克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Dorsalin-1-like基因的cDNA序列,并分析了Dorsalin-1-like mRNA在半滑舌鳎成鱼的组织表达差异及其在早期发育阶段的表达水平变化。研究结果表明,半滑舌鳎Dorsalin-1-like基因cDNA全长为1 961 bp,包括了153 bp的5′非翻译区(5′UTR)、编码419个氨...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
扶晓琴 王娜 王佳林 陈松林 赵法箴
颗粒酶(granzyme， Gzm) B是免疫炎症反应必不可少的介质，可激活半胱天冬酶3，进而诱导靶细胞的凋亡。本研究通过PCR扩增和RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)颗粒酶B基因(CsGzmBl)的全长cDNA序列，并对其序列特征和表达水平进行了分析。结果显示，CsGzmBl cDNA全长为923 bp，开放阅读框长度为780 bp，编码259个氨基酸(前19个氨基酸残基为信号肽序列)，5′非编码区为49 bp，3′非编码区为94 bp。CsGzmBl的基因组结构比较保守，由5个外显子和4个内含子组成。CsGzmBl蛋白包含2个N端糖基化位点、1个催化三联体“His63Asp112Ser207”、1个“PHSRPYMA”结构域及6个保守的半胱氨酸。荧光定量PCR结果显示，CsGzmBl在半滑舌鳎健康成鱼不同组织中均有表达，其中，在脾脏中表达量最高，头肾、中肾、肝脏和鳃中次之，在肌肉中表达量最低。与对照组0 h相比，CsGzmBl在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染后的不同时间点的脾脏、肠、肝脏、皮肤、鳃和肾脏中的表达水平均有不同程度的上调。这些结果表明，CsGzmBl基因在半滑舌鳎抵御哈维氏弧菌感染过程中发挥重要作用。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
郝先才 冯博 邵长伟 王倩
鱼类的性别决定和分化不仅受到遗传因素的控制，同时也受到环境因素的影响。皮质醇在鱼类应对外界环境压力的过程中起到重要调控作用，而hsd11b1l和hsd11b2具有调节体内皮质醇浓度的重要功能。本研究克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) hsd11b1l和hsd11b2基因的cDNA全长序列，分析了其序列特征，研究了其时空表达特征及温度响应的表达规律。结果显示，hsd11b1l cDNA全长为1650 bp，开放性阅读框长度为864 bp，编码287个氨基酸；hsd11b2 cDNA全长为4526 bp，开放性阅读框长度为1209 bp，编码402个氨基酸。半滑舌鳎不同组织和性腺发育时期的表达分析结果显示，hsd11b1l在肝脏中表达量最高，在卵巢的表达量是精巢的2倍，且在6月龄和3龄鱼的卵巢中呈现较高表达；而hsd11b2主要在精巢中表达，在6月龄鱼的精巢中表达量最高，随后表达量急剧降低，在卵巢中各个时期几乎不表达。半滑舌鳎温度响应的表达结果显示，高温(28℃)处理,2个月后，与正常温度(22℃)对照组相比，hsd11b1l和hsd11b2在雄鱼中的表达量均显著降低(P<0.05)。本研究探讨了hsd11b1l和hsd11b2基因在半滑舌鳎性别分化过程中的表达规律，为研究环境温度与半滑舌鳎性别分化之间的关系奠定了基础。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
柳淑芳 马骞 马慧 孙中之 柳学周 庄志猛
为研究半滑舌鳎雌雄个体大小和生长速度差异悬殊的分子机理,采集来自同一亲本、同一发育阶段的半滑舌鳎雄鱼和雌鱼脑垂体,分别与Affymetrix的斑马鱼基因芯片杂交,筛选差异表达基因。芯片杂交结果显示二者共有1 051个基因检测到明显的杂交信号,其中上调基因486个,下调基因561个。进一步比较雄鱼和雌鱼杂交信号的比值(Ratio值),有39个基因的Ratio值小于0.6或大于1.5,其中sh3gl1b、meis2.1、acta1、Noxa、slc25a5这5种上调基因和col1a2、klf7、acta2这3种下调基因可能与半滑舌鳎雌雄生长差异相关。这一结果为深入研究半滑舌鳎雌雄性别分化与生长调控...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张红 陈松林 刘洋 温海深 朱颖
从半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)全基因组序列中获得肿瘤抑制基因WT1a的部分序列,然后利用RACE技术克隆了WT1a基因的全长,运用组织学方法,对半滑舌鳎性腺分化早期的组织切片进行了观察,并分析了该阶段WT1a的表达特征。克隆结果显示,WT1a基因cDNA全长为1 886 bp,开放阅读框(ORF)长为1 470 bp,编码490个氨基酸,并且包含KTS三肽,5′-UTR和3′-UTR分别长为245 bp和171 bp。在ORF末端发现2个微卫星(SSR)序列和2个跨膜螺旋区域,而在其他物种中未发现这些区域。氨基酸序列分析显示,WT1a基因的保守性很高,与人的同源性高...
[期刊] 水产学报
[作者]
李斌 徐永江 柳学周 史宝 王滨 朱学武
为了在蛋白水平上认识半滑舌鳎食欲素Ａ（ｏｒｅｘｉｎ Ａ）的摄食调控作用及机制，利用原核表达载体ｐｅＴ３２Ａ成功构建了重组半滑舌鳎ｏｒｅｘｉｎ Ａ／ｐｅＴ３２Ａ质粒，转化至大肠杆菌ＢＬ２１后经ｉｐＴＧ诱导获得了ｎ端含６个组氨酸的半滑舌鳎ｏｒｅｘｉｎＡ重组蛋白。获得的重组蛋白大小为２４．９ ｋｕ，３２℃下用１．０ ｍｍｏＬ／Ｌ的ｉｐＴＧ诱导６ ｈ目的蛋白表达量最高，占菌体总蛋白的５２．８％，并主要分泌在上清液中。ＷｅｓＴｅｒｎ ＢＬｏＴＴｉｎＧ免疫印迹表明，获得的ｏｒｅｘｉｎ Ａ重组蛋白可被６×ｈｉｓ抗体特异性识别。ｎｉ～（２＋）－ｎＴＡ亲和层析柱纯化获得了高纯度的半滑舌鳎ｏｒｅｘｉｎ Ａ重组蛋白．．．
关键词：
半滑舌鳎 食欲素 原核表达 生物活性
[期刊] 中国水产科学
[作者]
胡乔木 王凯琳 陈松林
通过分析半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Dmrt1重组蛋白注射卵巢后基因表达调控,探讨Dmrt1在半滑舌鳎性别决定与分化中的功能。实验利用原核表达系统(Pet-32a)对半滑舌鳎Dmrt1基因进行重组表达,并通过亲和层析纯化获得了重组目的蛋白(Pet-32-dmrt1)。重组蛋白注射卵巢后实时定量PCR分析结果显示,Cyp19a和Foxl2在6~24 h内两基因表达量均显著下调,Sox9a基因表达量在6~24 h内有显著上调,但48 h后3个基因的表达量逐渐恢复正常表达水平。研究结果证实,Dmrt1重组蛋白具有生物活性,且对性别相关基因表达调控具有一定的影响,在性别决定...
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