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[期刊] 水产学报
[作者]
李斌 徐永江 柳学周 史宝 王滨 朱学武
为了在蛋白水平上认识半滑舌鳎食欲素Ａ（ｏｒｅｘｉｎ Ａ）的摄食调控作用及机制，利用原核表达载体ｐｅＴ３２Ａ成功构建了重组半滑舌鳎ｏｒｅｘｉｎ Ａ／ｐｅＴ３２Ａ质粒，转化至大肠杆菌ＢＬ２１后经ｉｐＴＧ诱导获得了ｎ端含６个组氨酸的半滑舌鳎ｏｒｅｘｉｎＡ重组蛋白。获得的重组蛋白大小为２４．９ ｋｕ，３２℃下用１．０ ｍｍｏＬ／Ｌ的ｉｐＴＧ诱导６ ｈ目的蛋白表达量最高，占菌体总蛋白的５２．８％，并主要分泌在上清液中。ＷｅｓＴｅｒｎ ＢＬｏＴＴｉｎＧ免疫印迹表明，获得的ｏｒｅｘｉｎ Ａ重组蛋白可被６×ｈｉｓ抗体特异性识别。ｎｉ～（２＋）－ｎＴＡ亲和层析柱纯化获得了高纯度的半滑舌鳎ｏｒｅｘｉｎ Ａ重组蛋白．．．
关键词：
半滑舌鳎 食欲素 原核表达 生物活性
[期刊] 水产学报
[作者]
徐永江 李斌 柳学周 张凯 史宝 王滨 宋雪松
为了认识食欲素(orexin)编码的多肽orexin B对半滑舌鳎摄食的调控作用及机制,利用原核表达载体p ET-32a成功构建了重组半滑舌鳎orexin B/pET-32a质粒,转化至大肠杆菌BL21后,经IPTG诱导获得了N端含6个组氨酸分子标签的orexin B重组蛋白。重组蛋白大小为21.14 ku,在温度37°C条件下以1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h的orexin B重组蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的43.5%,并主要分泌于上清液中。Western blotting免疫印迹表明,获得的
[期刊] 水产学报
[作者]
张雅星 王滨 柳学周 徐永江 史宝 姜燕 崔爱君 张正荣 孙冉冉
根据半滑舌鳎lepa和lepb编码氨基酸序列合成开放阅读框ORF肽段。利用原核表达载体pEQ30成功构建了半滑舌鳎lepa/pQE30和lepb/pQE30重组质粒,分别转化至大肠杆菌M15后,经IPTG诱导获得了N端含6个组氨酸的半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白。获得的重组蛋白大小均为16 ku,37°C下用0.5 mmol/L的IPTG诱导4 h后目的蛋白表达量最高,主要以包涵体形式存在。检测半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白浓度分别为0.3和0.25 mg/mL。Western blot免疫印迹和质谱分析表明,获得的LepA和LepB重组蛋白均具有免疫活性且序列正确。Ni2+-NTA亲和层析柱纯化可获得高纯度的半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白。离体孵育实验表明,获得的半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白能显著抑制半滑舌鳎下丘脑lepa、lepb和gnrh3 mRNA的表达水平,表明获得的重组蛋白具有明显的生物活性。研究结果可为探究leptin在半滑舌鳎生长发育中的调控机制提供重要参考。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
徐永江 柳学周 张凯 武宁宁 刘芝亮 李春广
为在蛋白水平认识半滑舌鳎类胰岛素生长因子Ⅱ（ＩＧＦ－Ⅱ）的生理功能，将ＩＧＦ－Ⅱ成熟肽序列克隆到原核表达载体ｐ ＥＴ－２８ａ中，成功构建了重组半滑舌鳎ＩＧＦ－Ⅱ／ｐ ＥＴ２８ａ质粒，导入到Ｅ．ｃｏｌＩ Ｂｌ２１（ＤＥ３）菌株后经ＩｐＴＧ诱导，获得了大小为１１．４ ｋ Ｄａ的重组ＩＧＦ－Ⅱ蛋白，Ｎ端含６个组氨酸，可特异性地被６×ＨＩｓ抗体识别。重组ＩＧＦ－Ⅱ蛋白在最优诱导条件３７℃诱导２ Ｈ，目的蛋白表达量占重组表达菌总蛋白的４３．７％，重组蛋白主要以包涵体存在。将获得的重组蛋白包涵体经变性、纯化和复性后，获得了纯化的ＩＧＦ－Ⅱ重组蛋白，其可在体外显著促进人乳腺癌ＭＤａ２３１细胞的增殖，表明ＩＧ．．．
关键词：
半滑舌鳎 IGF-Ⅱ 原核表达 生物活性
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
徐永江 柳学周 张凯 武宁宁 刘芝亮 李春广
为在蛋白水平认识半滑舌鳎类胰岛素生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)的生理功能,将IGF-Ⅱ成熟肽序列克隆到原核表达载体p ET-28a中,成功构建了重组半滑舌鳎IGF-Ⅱ/p ET28a质粒,导入到E.coli BL21(DE3)菌株后经IPTG诱导,获得了大小为11.4 k Da的重组IGF-Ⅱ蛋白,N端含6个组氨酸,可特异性地被6×His抗体识别。重组IGF-Ⅱ蛋白在最优诱导条件37℃诱导2 h,目的蛋白表达量占重组表达菌总蛋白的43.7%,重组蛋白主要以包涵体存在。将获得的重组蛋白包涵体经变性、纯化和复性后,获得了纯化的IGF-Ⅱ重组蛋白,其可在体外显著促进人乳腺癌MDA231细胞的增殖,表明IG...
关键词：
半滑舌鳎 IGF-Ⅱ 原核表达 生物活性
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘芝亮 徐永江 柳学周 史宝 王妍妍
根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Güther)类胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-I)基因的cDNA序列,设计引物扩增编码IGF-I成熟肽序列,此序列由210个碱基组成,包括B-C-A-D 4个功能域。利用PCR方法将扩增片段克隆到原核表达载体pET-28a上,得到重组质粒,将重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导产生N端含6个组氨酸的融合蛋白。以SDS-PAGE电泳检测和SigmaScan软件分析获得的多肽,结果表明:IGF-I融合蛋白大小为11.4 kD,IPTG诱导3 h时目的蛋白表达量最高,占细菌总蛋白的58.5%,1 L菌液表达目的蛋白40.7...
关键词：
半滑舌鳎 IGF-I 原核表达 生物活性
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
史学营 徐永江 武宁宁 柳学周 杨洪军 臧坤 史宝 李存玉
为认识养殖半滑舌鳎无眼侧黑化的细胞学特性，利用显微观察方法研究了其皮肤黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞的形态特征，比较了３种色素细胞在有眼侧皮肤、无眼侧正常和黑化皮肤中的数量分布特征。为进一步揭示无眼侧黑化的分子机制，克隆了半滑舌鳎ＰＯＭＣ基因的Ｃ ＤＮＡ序列。结果显示，黑色素细胞较大，含黑色和棕色的色素颗粒，有树突状分枝不明显和延伸成放射状两种形态；黄色素细胞较小，含黄色素颗粒；虹彩细胞最小，含鸟粪素颗粒。半滑舌鳎ＰＯＭＣ基因的Ｃ ＤＮＡ序列长９１０ ｂＰ，包括一个１１４ ｂＰ的５＇非翻译区和一个１５４ ｂＰ的３＇非翻译区，开放阅读框长度为６４２ ｂＰ，共编码２１３个氨基酸，包含ＡＣＴＨ、α．．．
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
史学营 徐永江 武宁宁 柳学周 杨洪军 臧坤 史宝 李存玉
为认识养殖半滑舌鳎无眼侧黑化的细胞学特性,利用显微观察方法研究了其皮肤黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞的形态特征,比较了3种色素细胞在有眼侧皮肤、无眼侧正常和黑化皮肤中的数量分布特征。为进一步揭示无眼侧黑化的分子机制,克隆了半滑舌鳎POMC基因的c DNA序列。结果显示,黑色素细胞较大,含黑色和棕色的色素颗粒,有树突状分枝不明显和延伸成放射状两种形态;黄色素细胞较小,含黄色素颗粒;虹彩细胞最小,含鸟粪素颗粒。半滑舌鳎POMC基因的c DNA序列长910 bp,包括一个114 bp的5'非翻译区和一个154 bp的3'非翻译区,开放阅读框长度为642 bp,共编码213个氨基酸,包含ACTH、α...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
史宝 李晓晓 柳学周 徐永江 王珊珊 刘芝亮 王妍妍
采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法,首次获得全长为1319bp的半滑舌鳎膜孕激素受体(mPRα)的cDNA序列;将推断的氨基酸序列与其他物种mPRα氨基酸序列进行多重比较分析,发现存在7个跨膜区域。使用MEGA4.0临位相联法和ClustalX方法对mPRα的氨基酸序列进行聚类分析和序列相似度分析。结果表明,半滑舌鳎mPRα与漠斑牙鲆、大西洋绒须石首鱼以及青鳉等鱼类的mPRα聚为一支,亲缘关系较近,相似度较高,分别为94%、93%和90%;而与高等哺乳动物人和牛相似性均为53%,亲缘关系较远。应用半定量RT-PCR技术分析了mPRαmRNA在性成熟雌性半滑舌鳎不同组织的表达,结果表明,...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王凯琳 胡乔木 陈松林
通过对半滑舌鳎（Ｃｙｎｏｇｌｏｓｓｕｓ ｓｅｍｉｌａｅｖｉｓ）进行全基因组及转录组测序，预测了一个半滑舌鳎性别相关基因ＣｓＦＲ２，目前已对该基因进行了克隆和表达分析。为进一步研究ＣｓＦＲ２基因的功能，本研究从蛋白层面入手，构建了原核表达载体ｐ ｅＴ－３２ａ－ＣｓＦＲ２，转化到大肠杆菌ｅ．Ｃｏｌｉ进行诱导表达，用Ｈｉｓ ＴＲａｐ进行蛋白纯化，ｓＤｓ－ｐａｇｅ电泳检测诱导及纯化产物，并将表达纯化的ＣｓＦＲ２蛋白注射１龄半滑舌鳎精巢。由于ＣｓＦＲ２是一个性别相关基因，因此无法通过免疫反应来直接检测其蛋白活性，本研究通过不同时间点取样检测半滑舌鳎其他性别相关基因Ｃｙｐ１９ａ和Ｆｏｘｌ２的表达量变化，来．．．
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王凯琳 胡乔木 陈松林
通过对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)进行全基因组及转录组测序,预测了一个半滑舌鳎性别相关基因CSFR2,目前已对该基因进行了克隆和表达分析。为进一步研究CSFR2基因的功能,本研究从蛋白层面入手,构建了原核表达载体p ET-32a-CSFR2,转化到大肠杆菌E.coli进行诱导表达,用His Trap进行蛋白纯化,SDS-PAGE电泳检测诱导及纯化产物,并将表达纯化的CSFR2蛋白注射1龄半滑舌鳎精巢。由于CSFR2是一个性别相关基因,因此无法通过免疫反应来直接检测其蛋白活性,本研究通过不同时间点取样检测半滑舌鳎其他性别相关基因Cyp19a和Foxl2的表达量变化,来...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
马骞 柳淑芳 庄志猛 唐启升
根据已克隆的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)生长激素(GH)基因和生长激素受体Ⅰ(GHR-Ⅰ)基因的cDNA序列信息设计引物,用于扩增半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因序列。随后,分别利用表达载体pET-32a和pGEX-6P-1成功构建了包含半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因ORF全序列及不同ORF片段的6个重组质粒,并将获得的重组质粒在表达宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示:重组GH的pET-32a-CSGH质粒在40 kD处有特异性的蛋白条带,重组GHR-Ⅰ胞内区的pGEX-6P-1-CSG...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张红 陈松林 刘洋 温海深 朱颖
从半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)全基因组序列中获得肿瘤抑制基因WT1a的部分序列,然后利用RACE技术克隆了WT1a基因的全长,运用组织学方法,对半滑舌鳎性腺分化早期的组织切片进行了观察,并分析了该阶段WT1a的表达特征。克隆结果显示,WT1a基因cDNA全长为1 886 bp,开放阅读框(ORF)长为1 470 bp,编码490个氨基酸,并且包含KTS三肽,5′-UTR和3′-UTR分别长为245 bp和171 bp。在ORF末端发现2个微卫星(SSR)序列和2个跨膜螺旋区域,而在其他物种中未发现这些区域。氨基酸序列分析显示,WT1a基因的保守性很高,与人的同源性高...
[期刊] 水产学报
[作者]
朱颖 孟亮 胡乔木 王晓夏 常亚青 陈松林
利用半滑舌鳎性腺转录组测序获得的StAR基因部分序列,设计RACE引物,克隆了半滑舌鳎StAR基因的cDNA序列,全长为1 294 bp,5'端UTR为132 bp,3'端UTR为310 bp,开放阅读框(ORF)为852 bp,共编码283个氨基酸。将半滑舌鳎StAR基因与其他物种StAR基因进行氨基酸同源性分析,结果显示,半滑舌鳎StAR与塞内加尔鳎、大口黑鲈、花鲈、金头鲷的同源性都达到了85%,与虹鳟、斜带石斑鱼及日本鳗鲡的同源性分别为81%、83%和76%。雌、雄鱼不同组织StAR基因的表达分析表明,StAR基因在雄鱼性腺中高表达,在雄鱼的肝脏、脑及心脏中表达量较低,而在雄鱼的其他组织...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘万军 张丽燕 邵长伟 王凯琳 齐茜 陈松林 温海深
生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45(growth arrest and DNA damage inducible protein 45,Gadd45)基因在胚胎发育和性别决定中起重要作用。本研究通过RACE方法在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆得到了1个Gadd45g同源基因,命名为Gadd45g3。该基因全长1 147 bp,编码155个氨基酸残基。氨基酸序列分析表明,半滑舌鳎Gadd45g3与其他鱼类Gadd45g-like的同源性为79%~88%,与硬骨鱼和高等脊椎动物的Gadd45g同源性为58%~67%。对多个物种的Gadd45g同源基因的CDS区进行Ka...
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