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[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘芝亮 徐永江 柳学周 史宝 王妍妍
根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Güther)类胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-I)基因的cDNA序列,设计引物扩增编码IGF-I成熟肽序列,此序列由210个碱基组成,包括B-C-A-D 4个功能域。利用PCR方法将扩增片段克隆到原核表达载体pET-28a上,得到重组质粒,将重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导产生N端含6个组氨酸的融合蛋白。以SDS-PAGE电泳检测和SigmaScan软件分析获得的多肽,结果表明:IGF-I融合蛋白大小为11.4 kD,IPTG诱导3 h时目的蛋白表达量最高,占细菌总蛋白的58.5%,1 L菌液表达目的蛋白40.7...
关键词：
半滑舌鳎 IGF-I 原核表达 生物活性
[期刊] 水产学报
[作者]
王亚楠 刘旭东 穆琳琳 刘志鹏 李春梅 于海洋 张全启
为进一步研究半滑舌鳎midkine(MK)成熟肽活性与功能,对半滑舌鳎生长因子MK成熟肽进行定点改造及原核表达。根据大肠杆菌偏爱密码子的特点,实验利用SOEing PCR法对半滑舌鳎MK成熟肽进行定点突变。将改造后的半滑舌鳎成熟肽MK克隆到载体质粒pET32a(+),构建原核表达载体pET32a(+)-MK,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株中。SDS-PAGE结果显示,与对照组相比,经IPTG诱导表达后半滑舌鳎重组蛋白MK存在于大肠杆菌上清液中,产物相对分子质量约为33 ku。研究表明,本实验对半滑舌鳎生长因子midkine成功进行了定点改造,原核表达质粒成功构建并在大肠杆菌中...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
吴秀梅 徐黎明 赵景壮 刘淼 曹永生 卢彤岩 尹家胜
在鱼类胚胎发育过程中,胰岛素样生长因子-II(insulin-like growth factors-II,IGF-II)起着关键的作用。本研究根据Gen Bank收录的鲑鳟鱼IGF-II基因序列设计引物,以哲罗鱼(Hucho taimen)肝RNA提取物为模板,利用RT-PCR方法扩增出哲罗鱼IGF-II基因开放阅读框。将目的基因IGF-II与原核表达载体p SUMO连接构建出重组表达载体p SUMO-IGF。将该重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中进行目的蛋白的诱导表达。SDS-PAGE电泳分析显示,约在40 k D处含有清晰的条带,与预期结果相符;目的蛋白以包涵体形式存在。对包涵体进行...
[期刊] 水产学报
[作者]
陈圣毅 刘新富 徐永江 刘芝亮 柳学周 史宝 王妍妍
应用RT-PCR方法扩增七带石斑鱼类胰岛素生长因子-Ⅰ(esIGF-Ⅰ)成熟肽序列。该成熟肽序列由210个碱基组成,编码70个氨基酸,包括B-C-A-D 4个结构域。将此成熟肽片段导入原核表达载体pET-28a上,在IPTG诱导下成功在E.coli BL21(DE3)中融合表达。SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小为11 ku,在IPTG诱导后3 h表达量最高,占菌体总蛋白的51.8%,重组蛋白主要以包涵体形式存在。对重组蛋白进行变性、纯化和复性,获得了纯化的重组蛋白。Western-blotting免疫印迹分析表明,融合蛋白可特异性地被6×His抗体识别。细胞增殖实验表明,纯化的IGF-Ⅰ...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
臧坤 徐永江 柳学周 史宝 王妍妍
根据鲽形目和鲈形目鱼类的IGF-II基因保守序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆得到编码星突江鲽(Platichthys stellatus)IGF-II成熟肽的全长c DNA序列(210 bp),同源性分析显示IGF-II成熟肽在B、A和D区高度保守。利用原核表达载体p ET-28a构建了重组表达质粒(IGF-II/p ET28a),转化大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导,获得了N端含6个组氨酸的重组蛋白。37℃条件下用1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h,目的蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的42.7%。重组蛋白主要以包涵体形式存在,经SDS-PAGE电泳检测,IGF-II...
[期刊] 水产学报
[作者]
王晓玉 徐黎明 刘淼 赵景壮 卢彤岩 曹永生 尹家胜
为进一步了解哲罗鲑ＩＧＦ－Ｉ，实验采用逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，从哲罗鲑肝脏的总ＲＮＡ中扩增出胰岛素样生长因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）的Ｃ ＤＮＡ开放阅读框（ｏＰｅＮ ＲｅＡＤＩＮＧ ＦＲＡｍｅ，ｏＲＦ）序列。利用原核表达载体Ｐ Ｓ构建重组表达质粒（ＩＧＦ－Ｉ／Ｐ Ｓ），并将其转化到宿主大肠杆菌ＲｏＳｅＴＴＡ后经ＩＰＴＧ诱导获得重组哲罗鲑ＩＧＦ－Ｉ蛋白。经ＳＤＳ－ＰＡＧｅ电泳检测，在３５～５０ ｋｕ有条带与预期相符，且重组蛋白以包涵体的形式存在。包涵体经变性／复性实验后，获得纯化的ＩＧＦ－Ｉ融合蛋白。ｅＬＩＳＡ鉴定结果显示，目的蛋白能特异性识别抗鱼类ＩＧＦ－Ｉ抗体，表明获得了具有免疫．．．
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
张家荣 秦宏宇 谢婷 张效宇 李飞霞 吕俊贤 贾玉东
类胰岛素生长因子3 (insulin-like growth factor 3， IGF3)在硬骨鱼类性别分化过程中扮演重要角色，但其是否影响卵巢发育尚不明确。本研究以欧亚养殖良种大菱鲆(Scophthalmus maximus)为实验材料，通过RACE (rapid-amplification of cDNA ends)克隆技术，获得了IGF3全长cDNA序列，分析了其生物信息学特征，预测了其与IGF特异性受体(IGF receptors， IGF-1R， IGF-2R)结合情况，查明了其组织和卵巢不同发育时期表达规律。结果显示，大菱鲆IGF3 cDNA全长为1 255 bp，编码259个氨基酸。生物信息学分析发现，IGF3为亲水性蛋白，具有典型的IGF特异性结构域和信号肽序列，同大西洋庸鰈(Hippoglossus stenolepis)同源性最高；蛋白质三级结构域由3个α螺旋串联而成，同IGF-1R和IGF-2R紧密结合。组织表达分析显示，igf3在大菱鲆各个组织中均有分布，雌、雄大菱鲆表达规律显著不同，但皆在脑组织中表达最高。在卵巢发育过程中，igf3在卵黄生成后期表达量显著上升，在核迁移期达到最高，在闭锁期显著下降。以上结果表明，大菱鲆IGF3具有典型的IGFs家族结构特征，作为局域性内分泌因子，在组织中广泛分布且具有显著的性别二态性，同时参与调控了卵巢发育和成熟。相关结果为深入解析IGF3对大菱鲆卵巢发育和卵母细胞成熟的影响及其作用机制奠定了基础，同时也为探究鱼类IGF3新功能提供了重要思路。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
马骞 柳淑芳 庄志猛 唐启升
根据已克隆的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)生长激素(GH)基因和生长激素受体Ⅰ(GHR-Ⅰ)基因的cDNA序列信息设计引物,用于扩增半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因序列。随后,分别利用表达载体pET-32a和pGEX-6P-1成功构建了包含半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因ORF全序列及不同ORF片段的6个重组质粒,并将获得的重组质粒在表达宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示:重组GH的pET-32a-CSGH质粒在40 kD处有特异性的蛋白条带,重组GHR-Ⅰ胞内区的pGEX-6P-1-CSG...
[期刊] 水产学报
[作者]
赵晓杰 陈松林 王娜 王贤丽 邢士超
通过RT-PCR方法从大菱鲆肝组织克隆了胰岛素样生长因子-I(IGF-I)成熟肽片段,分析表明,此成熟肽由70个氨基酸残基组成,含有3个链内二硫键。将扩增片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,实现了IGF-I成熟肽和GST蛋白在Escherichia coli BL21(DE3)plysS中的融合表达。融合蛋白分子量约为34ku,诱导4h时占菌体总蛋白的59%,主要以包涵体形式存在。Western-blotting免疫印迹表明,融合蛋白可以特异性地被anti-GST抗体识别。包涵体经6mol/L盐酸胍变性溶解及脉冲法稀释复性后,通过GSTrapFF亲和预装柱纯化,获得了电泳分析纯的融合蛋...
[期刊] 水产学报
[作者]
李斌 徐永江 柳学周 史宝 王滨 朱学武
为了在蛋白水平上认识半滑舌鳎食欲素Ａ（ｏｒｅｘｉｎ Ａ）的摄食调控作用及机制，利用原核表达载体ｐｅＴ３２Ａ成功构建了重组半滑舌鳎ｏｒｅｘｉｎ Ａ／ｐｅＴ３２Ａ质粒，转化至大肠杆菌ＢＬ２１后经ｉｐＴＧ诱导获得了ｎ端含６个组氨酸的半滑舌鳎ｏｒｅｘｉｎＡ重组蛋白。获得的重组蛋白大小为２４．９ ｋｕ，３２℃下用１．０ ｍｍｏＬ／Ｌ的ｉｐＴＧ诱导６ ｈ目的蛋白表达量最高，占菌体总蛋白的５２．８％，并主要分泌在上清液中。ＷｅｓＴｅｒｎ ＢＬｏＴＴｉｎＧ免疫印迹表明，获得的ｏｒｅｘｉｎ Ａ重组蛋白可被６×ｈｉｓ抗体特异性识别。ｎｉ～（２＋）－ｎＴＡ亲和层析柱纯化获得了高纯度的半滑舌鳎ｏｒｅｘｉｎ Ａ重组蛋白．．．
关键词：
半滑舌鳎 食欲素 原核表达 生物活性
[期刊] 水产学报
[作者]
翟万营 张俊玲 施志仪 李巍
利用RACE-PCR技术,从牙鲆肝脏组织总RNA中克隆得到胰岛素样生长因子结合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein 1,IGFBP-1)基因的全长cDNA序列,该cDNA全长为1 070 bp,开放阅读框为729 bp,编码242个氨基酸。通过系统进化树分析,牙鲆IGFBP-1与鱼类IGFBP-1基因紧密聚为一支;通过同源性比对,牙鲆IGFBP-1基因的核苷酸序列与大菱鲆同源性最高,为95%,而其推导的氨基酸序列与其它鱼类如大菱鲆、五条、黄金鲈、红点鲑、鲤和斑马鱼的同源性分别为89%、89%、84%、79%、67%和67%。半定量RT-...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
王晓玉 纪锋 徐黎明 赵景壮 刘淼 曹永生 尹家胜
采用逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，从哲罗鲑（ＨｕＣＨｏ Ｔａｉｍｅｎ）肝脏的总Ｒｎａ中扩增出胰岛素样生长因子－Ⅰ（ｉＧＦ－Ⅰ）的Ｃ Ｄｎａ开放阅读框（ｏＰｅｎ ＲｅａＤｉｎＧ ＦＲａｍｅ，ｏＲＦ）序列，运用软件对其进行生物信息学分析，并利用荧光实时定量ＰＣＲ技术检测了哲罗鲑成鱼不同组织中ｉＧＦ－Ⅰ ｍＲｎａ的表达情况。结果显示，ｉＧＦ－Ⅰ基因的Ｃ Ｄｎａ开放阅读框为５７３ ｂＰ，编码１９０个氨基酸，蛋白质等电点为９．２１，氨基酸结构由信号肽、ｂ、Ｃ、ａ、Ｄ结构域及ｅ肽组成；氨基酸序列与其他鲑科鱼类具有较高的同源性，其中与北极红点鲑的ｉＧＦ－Ⅰ同源性最高（９９．２％）；组织表达分析显．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
任付真 姚韩韩 钱雪骏 林志华 董迎辉
为了研究IGF1R基因在泥蚶生长、发育过程中的调控作用,本研究基于泥蚶转录组文库的EST,利用SMART RACE技术首次克隆获得泥蚶IGF1R基因(Tg-IGF1R)c DNA全长序列,该序列全长为5793 bp,开放阅读框为4638 bp,编码1546个氨基酸。经生物信息学分析发现,该基因5′端非编码区为810 bp,3′端非编码区为345 bp,Tg-IGF1R蛋白分子量为176.01 ku,等电点为6.04,包含4个Ⅲ型纤粘连蛋白结构域,1个半胱氨酸富集区和1个酪氨酸激酶结构域,属于亲水性跨膜蛋白
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
梁宏伟 李忠 罗相忠 邹桂伟
为研究黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)胰岛素样生长因子结合蛋白1基因(IGFBP1)的特征,阐明IGFBP1基因在不同性别黄颡鱼组织中的表达特征和IGFBP1蛋白在雌、雄黄颡鱼肌肉中的表达差异,克隆IGFBP1基因的c DNA全长,并进行实时荧光定量PCR检测和Western Blot分析。结果表明:黄颡鱼IGFBP1基因c DNA全长为1 259 bp,其开放阅读框长度为714 bp,编码237个氨基酸,3'端和5'端非翻译区分别为407 bp和138 bp;黄颡鱼IGFBP1基
[期刊] 淡水渔业
[作者]
杨长庚 苏富强 文华 刘伟 魏开金
为探讨饲料中不同蛋白源(菜籽粕、发酵豆粕、鸡肉粉、肉骨粉)替代50%鱼粉对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)生长、消化酶活性及生长轴基因表达的影响。以克氏原螯虾(9.84±0.49)g为研究对象,将其分为5组(对照组、菜籽粕组、发酵豆粕组、鸡肉粉组、肉骨粉组),分别投喂不同蛋白源的实验饲料,养殖周期6周。结果显示:发酵豆粕组的增重率最高,但与对照组差异不显著;菜籽粕组的增重率显著低于对照组。发酵豆粕组、鸡肉粉组和肉骨粉组的肝胰脏蛋白酶活性与对照组差异不显著,菜籽粕组肝胰脏蛋白酶活性显著性低于对照组;发酵豆粕组脂肪酶活性最高,但与对照组差异不显著。发酵豆粕组小肠的胰岛素生长因子受体(IGF1R)相对表达量与对照组差异不显著,但显著高于其他三组;菜籽粕组、发酵豆粕组和肉骨粉组肝脏的IGF1R相对表达量显著高于对照组。结果表明:比较4种蛋白源替代50%鱼粉,发酵豆粕效果最佳,肉骨粉和鸡肉粉次之,菜籽粕最差。
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