【背景】副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪的上呼吸道病原菌，引起格拉瑟氏病，主要引起断奶前后和保育阶段的猪发病，通常见于5—8周龄的青年猪，发病率一般为10%—15%。该菌有15种血清型，目前主要养猪国家流行的血清型为4型、5型、12型和13型，是严重危害养猪业发展的主要细菌性病原之一。目前国内还没有检测该菌抗体的商品化试剂盒。【目的】研制一种针对副猪嗜血杆菌的快速、敏感和特异性强的抗体检测试剂盒，为格拉瑟氏病的有效防控提供技术支持。【方法】表达并纯化OppA、DppA、HbpA 3种不同的副猪嗜血杆菌ABC转运体周质底物结合蛋白，使用副猪嗜血杆菌阴、阳性参考血清筛选以上3种蛋白中免疫反应性和反应特异性好的蛋白。以筛选的蛋白为包被抗原，建立检测HPS抗体的间接ELISA方法，优化间接ELISA反应条件，并组装试剂盒。在此基础上，确定该试剂盒的敏感性、特异性；通过对不同时间、不同猪场采集的2 000份临床猪血清样本进行检测，评价该试剂盒的实用性；在以上临床血清样本中随机选取200份，分别以研制的试剂盒、间接血凝试验以及进口商品化试剂盒进行检测，比较检测结果，验证该试剂盒的符合率；最后，使用研制的试剂盒检测免疫和攻毒猪采集的血清，评价该菌免疫后的抗体消长规律。【结果】成功表达并纯化了OppA、DppA、HbpA 3种蛋白，发现OppA免疫反应性和反应特异性最好。经过反应条件优化，确定OppA包被浓度为1μg·mL-1，封闭液为0.5%的BSA-PBS溶液，样品稀释液为1%的BSA-PBST溶液，样品孵育时间为30min，样品稀释度为1:50，酶标二抗孵育时间为3 0min，底物作用时间为15 min，临界值为0.18；试剂盒的敏感性和特异性为96.67%，能与国内常见血清型HPS阳性血清反应而不与猪其他常见病原阳性血清发生交叉反应；2 000份临床血清样本阳性检出率为34.65%；随机抽取200份血清样本，与间接血凝试验的符合率为92.50%，与进口商品化试剂盒符合率为87.00%，符合率较高；使用试剂盒检测免疫和攻毒后不同时间采集的猪血清，HPS抗体消长规律符合预期。【结论】研制的副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒特异性高、敏感性强，与商品化试剂盒和间接血凝试验的符合率高，可用于临床HPS抗体检测和疫苗免疫效果评价。

【目的】研制一种检测胞内劳森菌（Lawsonia intracellularis,LI）抗体的间接ELISA试剂盒，为LI的监测和疫苗评价提供工具。【方法】表达并纯化LI的外膜蛋白Omp2，以其为包被抗原建立检测LI抗体的间接ELISA方法，优化ELISA反应条件；用建立的ELISA方法检测稀释的LI阳性血清来评价试剂盒的敏感性，检测其他病原的阳性血清来评价试剂盒的特异性；试制3批试剂盒，制定试剂盒的敏感性和特异性检验标准，测定试剂盒在4℃的保存期；用试制的试剂盒检测LI阴性和阳性质控血清，研究试剂盒的成立条件；通过对不同时间和猪场采集的1 000份临床猪血清样本的检测来评价该试剂盒的实用性；用本试剂盒与进口商品化试剂盒平行检测LI阳性和阴性血清各50份以评价试剂盒的符合率。【结果】成功表达并纯化了Omp2蛋白，蛋白纯度为90.31%，在Western blot试验中可以与LI阳性血清发生反应。ELISA最佳反应条件为：Omp2以200 ng/孔4℃包被12-16 h；血清1﹕50稀释，37℃孵育30 min；羊抗猪Ig G-HRP 1﹕20 000稀释，37℃孵育30 min;TMB底物37℃显色15 min，用0.5 mol·L^-1的硫酸终止反应。该试剂盒检测LI阳性血清的最高检出倍数为8，敏感性较好；试剂盒检测E.coli、App、Mhp、SS2、PRRSV、PRV的结果均为阴性，特异性较好。制定了试剂盒的敏感性和特异性检验标准。试剂盒在4℃可保存15个月。试剂盒的成立条件为：阳性标准血清OD_450nm≥1.25，阴性标准血清OD_450nm<0.3。试制的试剂盒批内、批间重复性试验变异系数均小于10%。与国外商品化ELISA检测试剂盒对比的符合率达86%。用试制的ELISA试剂盒检测1 000份华东部分地区临床猪血清样品，其中LI阳性检出率为59.90%，表明LI在华东地区猪群中普遍存在。【结论】本研究开发的LI间接ELISA抗体检测试剂盒特异性高，灵敏度高，与商品试剂盒符合率高，可用于临床LI抗体的检测。

本研究旨在研制一种以紧密素为检测靶标的间接ＥＬＩＳＡ技术，检测血清中产志贺毒素大肠杆菌（ＳｈＩｇＡ ｔｏｘＩｇＥｎＩｃ ＥＳｃｈＥｒＩｃｈＩＡ ｃｏＬＩ，ＳｔＥｃ）的抗体水平。根据紧密素２７个亚型的ｎ端保守序列，体外表达３９０～５４３ ＡＡ片段制备包被抗原，通过敏感性、特异性、重复性和稳定性实验，建立检测ＳｔＥｃ的抗体的间接ＥＩＩＳＡ方法。经优化筛选的间接ＥＬＩＳＡ最佳反应条件：抗原包被浓度３ ｎｇ／孔，待检血清稀释比例１∶２００，ｈｒＰ－兔抗羊Ｉｇ ｇ、ｈｒＰ－兔抗牛Ｉｇ ｇ的工作浓度均为１∶１５０００，５％脱脂奶封闭Ｌ ｈ，底物作用时间１０ｍＩｎ，用于牛、羊疫苗抗体检测或者ＳｔＥｃ大肠杆菌．．．

旨在建立一种基于重组副猪嗜血杆菌(HPS)外膜蛋白(Omp)P2的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。将重组表达的Omp P2纯化后作为ELISA包被抗原,建立了一种基于重组P2蛋白的间接ELISA方法,并对此方法的反应条件进行了优化。确定ELISA的最佳条件为:抗原包被浓度为1.5μg/mL,被检血清1∶80稀释,辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG(二抗)1∶4 000稀释。确定的阴性血清临界D450 nm值为0.231,阳性血清临界D450 nm值为0.280。将该ELISA方法与加拿大Biovet公司生产的副猪嗜血杆菌抗体检测试剂盒做相关比较,结果符合率为88.9%。本试验建立的方法...

为了建立一种准确、快速的副猪嗜血杆菌病原夹心ＥＬＩＳＡ检测方法，以副猪嗜血杆菌外膜蛋白Ｐ５的特异性单克隆抗体１Ｅ２作为捕获抗体，兔抗副猪嗜血杆菌多克隆抗体作为检测抗体，通过方阵滴定优化夹心ＥＬＩＳＡ检测方法最佳反应条件，并对该检测方法进行特异性、敏感性验证以及临床样品的检测应用。结果显示，该检测方法中单克隆抗体１Ｅ２最佳包被浓度为３．４３４μｇ／ｍ Ｌ，兔抗副猪嗜血杆菌多抗的最佳稀释浓度为３．３５０μｇ／ｍ Ｌ，用１０ ｍｇ／ｍ Ｌ明胶３７℃封闭１ ｈ优于其他封闭液，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多体最佳使用浓度为１∶４ ０００。该检测方法的特异性试验结果显示可检测出１５个血清型的副猪嗜血杆菌病．．．

【目的】利用表达纯化的副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis,HPS)外膜蛋白P5(outer-membrane protein P5,OMP5),建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测方法。【方法】克隆扩增HPS OMP5基因,并将OMP5基因与原核表达载体pET-32a(+)连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受体菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。亲和层析法纯化蛋白,尿素梯度透析复性,Western blot鉴定表达产物。将超声破碎抗原和复性蛋白分别按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其它条件进行优化...

采用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌(Hps)的寡肽结合蛋白(Opp A)基因,序列测定结果表明,扩增片段全长1654 bp.将扩增片段插入表达载体p GEX-6P-1中,转化BL21进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明,重组融合蛋白大小约为87 ku,以纯化的重组蛋白Opp A作为抗原,建立Hps抗体的间接ELISA检测方法.通过试验确定最佳的反应条件为:抗原包被浓度为1.0μg·孔-1,于37℃包被1 h,待检血清的稀释度为1∶50,阳性判断标准(D450 nm)大于0.643.特异性和重复性试验结果表明,建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和稳定性,可用于Hps抗体的检测.

【目的】研制一种能有效指示假阴性的PCR检测产品,用于沙门氏菌快速、准确、灵敏的检测。【方法】针对沙门氏菌invA基因、stn基因序列分别设计引物与扩增内标,建立添加扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法,组装试剂盒,并对试剂盒的各项性能进行评价。【结果】试剂盒对147株沙门氏菌和28株非沙门氏菌的检测结果显示,所有沙门氏菌均能扩增出362 bp的目标条带,非沙门氏菌仅扩增出520 bp的内标条带。试剂盒检测沙门氏菌基因组DNA的检测限为8.0 fg/PCR,检测染菌量为4—5 CFU/10 mL的牛奶样品,增菌8—10 h即得到阳性结果。反复冻融60次或-20℃下贮存1年,均不影响试剂盒的使用效果...

在制备多克隆抗体的基础上,研制用于检测莠去津残留的间接竞争ELISA试剂盒。结果表明:莠去津抑制率回归曲线为y=19.762x+5.6026,相关系数R2=0.981,线性检测范围为1~5000μg·L-1,最低检测限为5.35μg·L-1,IC50为176.44μg·L-1。莠去津多克隆抗体的交叉反应率小于20%,莠去津试剂盒的添加回收率均高于75%,供试样品检测结果的批内和批间变异系数均低于10%。试剂盒在4℃或-20℃下贮存270d仍有效。

【目的】建立一种可快速检测副猪嗜血杆菌的环介导等温扩增(LAMP)方法。【方法】根据GenBank中副猪嗜血杆菌肽聚糖相关脂蛋白(PalA)基因序列,在其保守区域设计外引物、内引物和环引物用于LAMP检测。优化副猪嗜血杆菌LAMP检测的反应体系,在反应产物中加入SYBR GreenⅠ,对检测结果进行肉眼判定,建立副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法,评价该检测方法的特异性、敏感性。用建立的副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法对临床分离的8株不同血清型副猪嗜血杆菌进行检测。从疑似患副猪嗜血杆菌病的猪体内采集10种体液,用所建立的可视化LAMP检测方法进行检测。【结果】建立了副猪嗜血杆菌可视化LAMP...

【目的】建立快速检测副猪嗜血杆菌抗体的平板凝集试验方法,以便能够对副猪嗜血杆菌病进行快速、准确的诊断。【方法】利用9株(Ea、Ec、Ew、A1、A2、B1、B2、C1、C2)副猪嗜血杆菌陕西分离株制备平板凝集抗原,用其免疫健康家兔制备血清抗体,建立副猪嗜血杆菌平板凝集检测方法,对制备抗原的优势菌株进行筛选,并对该方法的特异性、敏感性、抗原最佳工作浓度进行检测。【结果】选出Ew株作为制备抗原的种子菌株,成功建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的平板凝集试验方法;该方法具有良好的特异性和敏感性,抗原最适工作浓度为8×109 CFU/mL。采用本试验建立的副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法对临床血清样品的检测结果与...

【目的】建立合成多肽抗原检测FMD NSP抗体的ELISA方法。【方法】固相法合成特异性FMDV NSP B细胞表位肽,将其偶联在BSA载体蛋白上,作为抗原包被在ELISA板上,制备检测抗FMDV NSP抗体的ELISA试剂盒,并对该试剂盒进行方法考核。【结果】抗原包被浓度选择2.5μg·mL-1;检测199份血清标本,与美国UBI商品试剂盒符合率达到96.48%,与国产3ABC ELISA比较,符合率为97.48%,显示极好的一致性。【结论】该合成肽ELISA试剂盒可以用以检测NSP抗体,从而鉴别FMD的自然感染与疫苗免疫,试剂盒特异性强,重复性好、稳定性高,操作简便。

【目的】利用蛋白质连接技术合成氟罗沙星(FLE)人工抗原,制备FLE高亲和力抗体,通过建立、优化FLE的icELISA检测方法研制出快速、灵敏的FLE残留检测间接竞争ELISA试剂盒。【方法】用DCC法偶联FLE和载体蛋白BSA合成免疫原FLE-BSA,用混合酸酐法偶联FLE和载体蛋白OVA合成包被原FIE-OVA,通过紫外扫描法(UV Scan)和聚丙烯凝胶电泳法(SDS-PAGE)鉴定人工合成抗原。选择经初步鉴定成功合成的FLE-BSA免疫SPF级6—7周龄Balb/c雌性小鼠5只,采用多点免疫法,对小鼠背部皮下4-6点注射免疫,免疫剂量为30μg/只,初免,用FLE-BSA PBS溶液与...

在建立磺胺甲噁唑单克隆抗体(SMZmAb)杂交瘤细胞株和阻断ELISA方法的基础上,研制出SMZ残留快速检测试剂盒(SMZ-Kit),并对其性能进行了测定。结果表明,SMZ-Kit的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,相关系数R2=0.990 1,检测范围为1.0~128.0μg/L,灵敏度为0.73μg/L,半数抑制浓度(IC50)为11.5μg/L,检测限为1.0μg/L;饲料样、牛奶样的平均添加回收率为83.9%,83.3%,平均批内和批间变异系数均<15%;SMZ-Kit与磺胺嘧啶的交叉反应(CR%)为2.88%,与其他磺胺类药物无交叉反应;试剂盒在4℃可保存6个月。