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[期刊] 中国水产科学
[作者]
孙嘉阳 张子平 朱友芳 邹志华 韩坤煌 葛辉 王艺磊
从本实验室已有刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)转录组数据中筛选获得α-微管蛋白基因片段,利用5’RACE和3’RACE技术首次克隆获得其cDNA,全长为1602 bp,包含1356 bp的开放阅读框,编码451个氨基酸,预测蛋白质分子量为49.78 kD。生物信息学分析表明α-微管蛋白为亲水性非跨膜蛋白,氨基酸序列的第142～148位有特异且保守的GTP核苷酸结合位点(GGGTGSG)。对刺激隐核虫α-微管蛋白氨基酸序列进行同源性比对及进化树分析,发现其与间日疟原虫(Trypanosoma vivax)、丹氏锥虫(Trypanosoma danilewskyi)、八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)、尾刺耐格里原虫(Naegleria gruberi)、眼虫(Euglena gracilis)等的序列一致性高达94%～95%,且在系统进化树上聚为一支。采用实时荧光定量PCR技术对α-微管蛋白基因在刺激隐核虫3个生活史阶段的表达进行检测,结果显示α-微管蛋白基因的表达量在纤毛虫时期显著高于包囊和滋养体时期(P
[期刊] 中国水产科学
[作者]
付国良 黄玛娇 谢金珠 胡燕红 晏燕花 黄镇 黄晓红
对刺激隐核虫（ＣｒｙｐｔｏＣａｒｙｏｎ ｉｒｒｉｔａｎｓ）的小Ｇｔｐ酶ｒａｎ基因（Ｃｉ ｒａｎ）进行研究，以期为刺激隐核虫病原生物学研究及其防治提供理论基础。从刺激隐核虫滋养体／包囊前期ＣＤｎａ文库中筛选出Ｃｉ ｒａｎ基因的克隆，利用生物信息学方法对Ｃｉｒａｎ基因及其编码的蛋白进行结构与功能的预测；通过逆转录ｐＣｒ检测Ｃｉｒａｎ的ｍｒｎａ。结果表明其在刺激隐核虫的各个发育阶段均有表达。对Ｃｉｒａｎ基因开放阅读框内的非通用密码子进行改造，并构建重组质粒ｐ ＧＥＸ－４ｔ－１／Ｃｉｒａｎ，将其转化到大肠杆菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）后成功表达分子量为５１．３ ｋＤ的重组融合蛋白ｒＣｉｒａｎ。用ｒＣｉｒａｎ蛋白．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭燕 张彦明 高晨 韩俊 陈建明 石琦 高永军 周伟 董小平
为了研究微管相关蛋白2(M AP 2)在促进微管形成、维持微管稳定及促进轴突和树突细胞器转运等方面的作用,试验克隆了M AP 2微管结合区基因,构建了原核表达载体pET 32a-M AP 2并对其进行诱导表达,利用亲和层析法对表达产物进行纯化,研究了表达产物与微管蛋白之间的作用。结果表明,融合表达的人M AP 2微管结合区蛋白约43 ku,可与天然的微管蛋白发生分子间的结合作用,为M AP 2生理功能的研究奠定了基础。
关键词：
MAP2 表达纯化 微管蛋白
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王伟 白俊杰 劳海华 叶星 罗建仁
根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物,应用逆转录 聚合酶链式反应(RT PCR)方法,从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA,回收纯化后克隆到pGEM TEasyVector系统的T载体上。重组子的序列分析表明:所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp,编码240个氨基酸,包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明,草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性,其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高,为87...
关键词：
草鱼 Mx蛋白基因 基因克隆 原核表达
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
遇文婧 宋小双 邓勋 平晓帆 周琦 刘志华
【目的】研究刺激植物响应蛋白Epl1对木本植物山新杨的刺激响应功能,为开发新一代提高植物免疫的新型诱导剂奠定基础。【方法】从棘孢木霉ACCC30153菌株中克隆获得一个刺激植物响应蛋白基因Epl1,并进行序列分析和原核表达,将获得的原核重组蛋白rEpl1与山新杨组培苗进行互作,初步探讨rEpl1蛋白对山新杨生长、生理指标、以及生长和防御相关基因转录水平的影响。【结果】刺激植物响应蛋白基因Epl1的cDNA序列全长为417bp,预测蛋白分子量12.6 kDa,属于Cerato-platanin家族;通过构建
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王玉卿 赵继新 庞玉辉 降彦苗 陈新宏 武军 刘淑会
【目的】克隆华山新麦草(Psathyrostachys huashanica)的α-醇溶蛋白基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。【方法】采用同源克隆法从华山新麦草基因组DNA中分离克隆出α-醇溶蛋白基因并进行序列分析,将克隆的华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5克隆到表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET28a-Gli-Ns转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。【结果】从华山新麦草基因组DNA中克隆了4个α-醇溶蛋白基因:Gli-Ns-2(FJ713595)、Gli-Ns-3(GQ139525)、Gli-Ns-4(GQ1...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
邓杰夫 李魏 雷玲 洪艳云 刘双清 戴良英 易图永
为进一步了解柑橘黄龙病菌亚洲种Clas的致病机理，从Prasad预测的166种分泌蛋白中选取1个在柑橘植株中表达量较高的CLIBASIA–04580基因进行研究。提取感染柑橘黄龙病的柑橘叶片总DNA，经 PCR扩增得到 CLIBASIA–04580基因，切胶回收PCR产物双酶切连接到pET–28a载体上，使用菌落PCR和限制性内切酶双酶切鉴定筛选阳性克隆；转化大肠杆菌 BL21(DE3)，使用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导重组蛋白表达融合组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白，聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS–PAGE)检测重组蛋白的表达水平，然后使用蛋白纯化镍柱进行纯化。结果表明，携带组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白得到表达，且异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为1.5 mmol/L时相对表达量达到峰值，通过SDS–PAGE凝胶分析，与未经过镍柱纯化的蛋白原液比较可知成功纯化了CLIBASIA–04580重组蛋白。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
邓杰夫 李魏 雷玲 洪艳云 刘双清 戴良英 易图永
为进一步了解柑橘黄龙病菌亚洲种Clas的致病机理，从Prasad预测的166种分泌蛋白中选取1个在柑橘植株中表达量较高的CLIBASIA–04580基因进行研究。提取感染柑橘黄龙病的柑橘叶片总DNA，经 PCR扩增得到 CLIBASIA–04580基因，切胶回收PCR产物双酶切连接到pET–28a载体上，使用菌落PCR和限制性内切酶双酶切鉴定筛选阳性克隆；转化大肠杆菌 BL21(DE3)，使用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导重组蛋白表达融合组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白，聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS–PAGE)检测重组蛋白的表达水平，然后使用蛋白纯化镍柱进行纯化。结果表明，携带组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白得到表达，且异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为1.5 mmol/L时相对表达量达到峰值，通过SDS–PAGE凝胶分析，与未经过镍柱纯化的蛋白原液比较可知成功纯化了CLIBASIA–04580重组蛋白。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
袁志栋 王志亮 刘雨田 吴晓东 赵永刚 刘海生
目的克隆、分析水牛朊蛋白(prionprotein,PrP)成熟片段基因,并获取纯化的表达产物。方法将应用PCR技术扩增的水牛成熟PrP的核酸序列克隆到表达载体pET-32a,并分析其序列;把阳性克隆质粒pET-32a-BPrP转化表达菌BL21(DE3),鉴定纯化的表达产物。结果水牛朊蛋白成熟片段核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其他牛科动物的成熟PrP核酸、氨基酸序列间的相似性分别在97.1%和97.2%以上,并且发现水牛成熟PrP有5个重复序列,编码的氨基酸序列其中有2个九肽和3个八肽重复序列。具有较高的表达水平的PrP融合蛋白被纯化后,用Western印迹实验证明该蛋白具有PrP抗原活...
关键词：
水牛成熟PrP 克隆 序列分析 原核表达
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
申建梅 胡黎明 宾淑英 廖泓之 林进添
利用RT-PCR和RACE方法克隆获得瓜实蝇Bactrocera cucurbitae(Coquillett)普通气味结合蛋白(general odorant binding protein,GOBP)基因的cDNA全长序列,命名为BcucOBP。测序结果表明,BcucOBP开放阅读框全长447 bp,编码149个氨基酸。氨基酸序列比对及三维结构同源建模表明,此序列具有OBPs的典型特征,序列中具有6个保守的半胱氨酸和6个α螺旋区域。构建了重组表达载体pET28a(+)-BcucOBP,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在IPTG进...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李晓梅 陈永 李珣 钟国华
利用RT-PCR和RACE技术,以小菜蛾(Plutella xylostella)3龄幼虫的cDNA为模板,克隆获得泛素延伸蛋白基因Px-ubi(GenBank No.FJ527489),核苷酸序列全长537 bp,其中开放阅读框全长387 bp,编码129个氨基酸残基,预测分子质量为16.7 ku,等电点为9.1,与已知真核生物泛素延伸蛋白的同源性为92%～98%。RT-PCR结果显示Px-ubi在小菜蛾不同生长发育时期均有表达,其中卵期、3龄期和预蛹期含量较高,而成虫期含量较低。同源建模显示,Px-ubi的3D结构主要由1个α螺旋、4个β折叠以及β转角和不规则卷曲组成,4个β折叠两两反向平...
关键词：
小菜蛾 泛素 基因 克隆 原核表达
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
秦平伟 段明革 孙文婷 李名扬 徐晶
金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类富含Cys,能够结合重金属的低分子量蛋白质,广泛分布于生物界。在构建好的蜡梅花cDNA文库并进行EST分析的基础上,通过随机克隆测序得到了1个蜡梅金属硫蛋白的cDNA,命名为CpMetallothionein(CpMT)。CpMTcDNA全长为1083bp,基因内部含有一长度为240bp的开放阅读框,可编码79个氨基酸残基。将CpMT插入原核表达载体pET-32a,并转化Origami2感受态细胞。诱导表达产物经SDS-PAGE结果显示,目的蛋白约为30kD。表达的融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白2种形式存在,用His-Bind蛋白纯化回收试...
关键词：
金属硫蛋白 克隆 序列分析 原核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
芦星 范士龙 王水怡 王金明 李思媛 刘明明 刘雨桐 巴音查汗 刘丹丹 张伟
【目的】克隆马泰勒虫新疆株棒状体颈部蛋白4基因(RON4)并原核表达RON4蛋白。【方法】参考美国马泰勒虫WA株基因组数据及其他顶复门原虫RON4基因信息,设计特异性引物,以马泰勒虫新疆株DNA为模板克隆RON4基因片段,构建p ET-32a-RON4原核表达载体后进行原核表达与鉴定,并对RON4基因编码蛋白进行生物信息学分析。【结果】获得马泰勒虫新疆株RON4基因(NCBI登录号为:ON254212)。马泰勒虫新疆株与马泰勒虫WA株亲缘关系最近,RON4基因的核苷酸和氨基酸相似性分别为99.4%和99.0%;RON4基因在种间高度保守,其氨基酸序列与其他顶复门原虫具有高度相似的保守区域。成功构建了RON4蛋白原核表达载体,诱导表达获得分子质量为50 ku的重组包涵体蛋白;重组蛋白可与马泰勒虫阳性马血清特异性反应。生物信息学分析表明,马泰勒虫新疆株RON4蛋白的亲水性、柔韧性以及表面可及性较弱,B细胞表面抗原表位区域较少,形成表面抗原表位的结构基础条件不足。【结论】克隆获得了马泰勒虫新疆株RON4基因,并完成了原核表达及鉴定,该基因高度保守,在不同物种间可能具有相似的功能。
[期刊] 华北农学报
[作者]
连凯琪 纪爽 周玲玲 时志琪 王飞 张元臣
为了克隆黏虫丝氨酸蛋白酶的全基因序列，并进行原核表达，以黏虫为研究对象，利用RT-PCR扩增丝氨酸蛋白酶的部分基因，进而通过RACE技术，得到丝氨酸蛋白酶全基因，通过Blast等软件对获得基因序列和推导的蛋白质序列进行分析，并利用大肠杆菌表达系统对其进行表达。结果表明，成功克隆黏虫丝氨酸蛋白酶全基因，将其命名为MsPG,序列全长2 010 bp,开放阅读框为1 593 bp,编码530个氨基酸，蛋白质分子质量为67.6 ku,等电点为7.63,且具有含6个半胱氨酸的clip结构域，推测其为clip型丝氨酸蛋白酶。MsPG氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫序列一致性在70.00%～91.92%,其中与烟芽夜蛾(GenBank登录号：PCG78401.1)序列一致性最高，达到91.92%。成功构建重组质粒pET30a(+)-MsPG,其在大肠杆菌原核表达系统中0.1 mmol/L IPTG诱导下的最佳表达温度是25℃。综上，黏虫丝氨酸蛋白酶MsPG具有丝氨酸蛋白酶家族保守的功能位点，且能够在体外进行原核表达。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
付媛 张雪娟 赵俊龙 何永强 刘恩勇 卢福庄 江涛 冯尚连
为了得到重组的日本血吸虫22.6 ku膜相关蛋白,研究设计了1对引物,以日本血吸虫mRNA为模板,用RT-PCR方法克隆了576 bp的22.6 ku膜相关蛋白基因片段,测序结果表明,该片段与已公布的Sj22.6基因序列(U75510)同源性达到99%。将该基因片段插入原核表达载体pGEX-KG构建了原核表达质粒pGEX-Sj22.6,在大肠杆菌BL21 codn plus中表达获得了约48 ku的融合蛋白,经Western-blot检测,该重组蛋白具有良好的免疫原性。
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