腐皮综合征是近年来养殖刺参发生的严重疾病。发病时,刺参大批死亡,经济损失惨重。以其主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)DNA为模板,PCR扩增出16S-23S核糖体RNA基因间隔区序列,插入pMD19-T,转化大肠杆菌DH5α并测序。根据该间隔区序列,设计引物扩增177 bp的地高辛标记的探针。该探针对灿烂弧菌呈现特异性,而对其它细菌V.fluvialis,V.anguillarum,V.alginolyticus,Aeromonas hydrophila,V.harveyi,V.parahaemolyticus,V.vulnificus均呈阴性。探针对灿烂弧菌DNA的检出...

腐皮综合征是近年来刺参养殖最主要的疾病,导致刺参大批死亡和惨重的经济损失。根据其主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)的16S~23S间隔区序列,设计特异性引物,利用PCR技术,从纯化的V.splendidus DNA中成功地扩增出产物大小为177bp的DNA片断,并对此方法的灵敏度和特异性进行了研究。结果表明,PCR技术对V.splendidus DNA的检测灵敏度为0.5pg,并且对灿烂弧菌的DNA呈现特异性,而与其他细菌V.fluvialis、V.anguillarum、V.alginolyticus、Aeromonas hydrophila、V.harveyi、V.p...

以养殖刺参"腐皮综合征"的重要致病菌——灿烂弧菌Vibrio splendidus的16S～23S间隔区序列,设计特异性引物,用PCR方法制备地高辛(DIG)标记探针,建立了原位杂交技术检测感染刺参体内灿烂弧菌的技术方法,并利用该方法对人工感染刺参和健康刺参各组织进行检测。结果显示,感染刺参的体壁结缔组织、肌肉组织、肠粘膜上皮、辐水管等组织的原位杂交检测呈阳性,而与健康刺参组织无交叉反应。在感染组织中,阳性信号(显色)强弱清晰,能准确反映出灿烂弧菌的侵染部位及感染程度,这为探明灿烂弧菌的感染途径、感染病程等致病机理研究奠定了基础,也为养殖刺参疾病预防和健康管理提供了技术支撑。

2003年春季,山东省青岛地区刺参养殖场暴发了较为严重的传染性疾病-“腐皮综合征”,该病引起的死亡造成约30%的损失。养殖刺参的发病症状表现为:厌食、摇头、肿嘴、排脏、身体萎缩、口部溃烂乃至体表大面积溃疡。从患病个体溃疡部位分离得到一种优势细菌KL1,KL1经人工回接感染实验证明对健康刺参具有较强的致病性,且感染病参的症状与自然发病海参的症状相同。通过形态学、生理生化和16SrDNA分子生物学方法对该菌进行的分类鉴定表明,导致养成刺参“腐皮综合征”的致病菌是灿烂弧菌(Vibriosplendidus)。本文首次揭示了该地区“腐皮综合征”导致养成刺参大规模死亡的致病原因,对刺参病害防治和健康养殖...

从基因库中获取溶藻弧菌的胶原蛋白酶基因序列和外膜蛋白基因序列,根据基因的保守性用DNAStar分别设计2对引物,分别对溶藻弧菌基因组进行PCR扩增,用地高辛标记扩增的特异DNA片段以制备探针。分别用胶原蛋白酶DNA探针和外膜蛋白DNA探针对实验室保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌进行斑点杂交检测,检测结果表明,胶原蛋白酶基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应,而与霍乱弧菌、哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA等均无反应,表明该胶原蛋白酶DNA探针的特异性较强;而外膜蛋白基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应,但与哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA...

灿烂弧菌Vibrio splendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌,对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测灿烂弧菌的方法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为62℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.338x+37.67,相关系数为0.999,扩增效率为0.99,最低能检测到20个拷贝。实验结果表明,该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对灿烂弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。

以养殖刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征的2种致病菌:灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为抗原,分别制备兔抗血清。以载玻片为介质,建立了2种病原菌的间接荧光抗体检测技术(IFAT)。交叉反应、阻断试验和吸收试验结果均表明本方法特异性强。对人工感染实验中的养殖水体及发病刺参溃烂组织检测,可以检出水体和患病刺参溃烂组织中的相应病原菌,病原菌被染成明亮的黄绿色,检测灵敏度2.4×104cell/mL。冰冻切片检测结果显示,在刺参肿胀嘴部与溃烂肌肉处有大量染成黄绿色的细菌颗粒。结果表明...

从患病刺参体表病灶组织分离出菌株060330B,其优势度高达90%,人工回接感染试验证实其具有较强的致病性,可导致健康刺参出现与自然患病刺参相同的症状。通过形态学观察、API半自动化鉴定和常规生理生化试验的结果表明,菌株060330B具有假单胞菌属的特征,其表型特征与恶臭假单胞菌相似。对该菌株进行16SrRNA基因序列分析和构建系统发育树,结果显示其与恶臭假单胞菌的亲缘关系最近,相似率达到99.5%。菌株060330B可鉴定为恶臭假单胞菌,并视为养殖刺参腐皮综合征的致病原之一。通过对多起不同来源患病刺参的研究表明,使用年限长、淤泥层厚呈黑色并伴有腥味的养殖池塘在该时期容易导致刺参腐皮综合征的发...

用改良二倍稀释法和抑菌圈法测定了24种单方中草药和9种复方中草药对刺参腐皮综合征4种重要病原菌灿烂弧菌、假交替单胞菌、哈维氏弧菌和恶臭假单胞菌的体外抑菌活性。结果显示,不同中草药对特定病原菌抑菌效果差异较大,单方中草药最低抑菌浓度(MIC)为1.56mg/ml,中草药水煎剂H-5和H-9对假交替单胞菌的抑菌圈最大,达22mm。单方中草药中穿心莲、大青叶、金银花和川芎4种中草药对4株病原菌抑菌效果最好,其水煎剂对4株病原菌平均抑菌浓度分别为6.25、7.81、5.86和3.52mg/ml;平均抑菌圈直径分别是17.5、11.3、14.0和11.5mm。将筛选的4种单方中草药组成9种复方,复方MI...

2013年夏季山东地区某刺参育苗场处于保苗期的刺参苗种暴发腐皮综合征疾病,表现为附着力下降、棘刺顶端溃烂、排脏、表皮溃疡和自溶等症状。自患病个体病灶组织分离优势细菌,并利用形态学观察、生理生化测定、回接感染、16S r DNA基因序列分析等方法完成致病原的鉴定。此外,通过对发病前后养殖系统中优势菌丰度的变化,追踪确定了所分离病原菌的致病阈值。结果显示,从患病参苗体表病灶处分离的一株优势菌HP130917A-1,经回接感染证实,该菌株具有较强的致病力,其对刺参苗种的半致死浓度为1.2×106 CFU/ml。生理生化结合分子鉴定表明,该菌株为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。此...

２０１３年夏季山东地区某刺参育苗场处于保苗期的刺参苗种暴发腐皮综合征疾病，表现为附着力下降、棘刺顶端溃烂、排脏、表皮溃疡和自溶等症状。自患病个体病灶组织分离优势细菌，并利用形态学观察、生理生化测定、回接感染、１６Ｓ ｒＤＮＡ基因序列分析等方法完成致病原的鉴定。此外，通过对发病前后养殖系统中优势菌丰度的变化，追踪确定了所分离病原菌的致病阈值。结果显示，从患病参苗体表病灶处分离的一株优势菌ＨＰ１３０９１７Ａ－１，经回接感染证实，该菌株具有较强的致病力，其对刺参苗种的半致死浓度为１．２×１０６ ＣＦＵ／ｍｌ。生理生化结合分子鉴定表明，该菌株为溶藻弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ＡｌｇｉＮｏｌｙｔｉＣＵＳ）。此外．．．

2003~2005年冬、春季,山东省和辽宁省众多养殖区域的保苗期刺参(Apostichopus japonicus)暴发了较为严重的传染性疾病—“腐皮综合征”。该病波及面广,传染性强,死亡率常高达90%以上。发病症状主要表现为:厌食、摇头、肿嘴、排脏、身体萎缩、口部溃烂乃至体表大面积溃疡。本研究对症状较为典型的3家海参保苗期的发病幼参进行了详细的病原学分析,从所有病参的病灶组织分离得到了1种占有绝对优势的菌株,经人工感染实验证明它对健康刺参具有较强的致病性,且感染病参的症状与自然发病海参的症状相同。通过形态学、生理生化和16S rDNA分子生物学方法对该菌进行的分类鉴定表明,导致保苗期刺参“腐...

硫酸软骨素在生物体应对病毒和细菌感染中起着重要作用,为研究硫酸软骨素合酶1(chondroitinsulfate synthase-1, ChSy-1)在仿刺参(Apostichopus japonicus)受到灿烂弧菌(Vibrio splendidus)感染后的作用,本研究开展了仿刺参ChSy-1基因(AjChSy-1)全长序列克隆和结构及系统进化分析,并采用荧光定量PCR技术测定了该基因在刺参不同组织中的表达差异及灿烂弧菌感染下的表达模式。结果显示,AjChSy-1基因cDNA全长为2756bp,其中,5′-UTR长度为194 bp, 3′-UTR为228 bp, ORF为2334 bp,编码777个氨基酸。AjChSy-1基因编码的蛋白含有糖基转移酶保守性DXD基序、β3-糖基转移酶基序及β4-糖基转移酶基序等结构。刺参基因组比对发现在chr13染色体上存在2个AjChSy-1基因拷贝。系统进化分析表明,刺参AjChSy-1编码蛋白与玉足海参(Holothurialeucospilota)和棘冠海星(Acanthaster planci)的蛋白亲缘关系较近,与斑马鱼(Danio rerio)、智人(Homo sapiens)等脊椎动物的蛋白亲缘关系较远。荧光定量PCR显示, AjChSy-1基因具有广泛的组织表达特性,其中,体腔细胞中表达量最高,体壁、性腺(雄性和雌性)和纵肌次之。在响应灿烂弧菌侵染过程中,随灿烂弧菌侵染时间增加,体壁中AjChSy-1表达量呈现先上升后下降的趋势,在第3、6、9天分别为对照组的1.79、2.06、3.12倍,对发病期抗病群体和易感群体中该基因的检测结果表明,易感群体体壁该基因表达量显著低于抗病群体(P<0.05),表达量降低11.4%。推测该基因可能在刺参应对灿烂弧菌中发挥免疫防御作用,相关研究结果为解析刺参AjChSy-1基因功能以及抗病分子调控机制提供了参考数据。

microRNA参与基因的转录后调控，在真核生物的生长发育、细胞分化和免疫防御等过程中发挥重要作用。刺参(Apostichopus japonicus)病害问题已成为产业发展的主要限制因素之一，而其病害发生的分子机制尚待进一步完善。本研究以刺参重大疾病“腐皮综合征”的重要致病原灿烂弧菌(Vibrios splendidus)为侵染菌株，通过人工侵染实验制备患病刺参样本，采用miRNA-seq技术对侵染组(PT16S)和对照组(PT10H)各3头刺参的体壁组织进行miRNA测序，通过相关生物信息学软件对miRNAs进行鉴定和分析，筛选差异表达miRNAs (DEmiRNAs)并预测其靶基因，构建关键调控途径的miRNA-mRNA调控网络。测序结果显示，PT10H组平均得到5 902 588条有效序列，194个已知miRNA和19个新的miRNA；PT16S组平均得到5 053 529条有效序列，182个已知miRNA和42个新的miRNA。对2组鉴定到的miRNA进行差异表达分析，共筛选到2个上调和11个下调的具有显著差异的DEmiRNAs (P≤0.05)，上调的DEmiRNAs靶基因预测结合到3010个靶基因，注释到585个GO terms以及24条代谢通路(P≤0.05)，下调的DEmiRNAs靶基因预测到19 072个靶基因，注释到514个GO terms以及22条代谢通路(P≤0.05)。对筛选到的DEmiRNAs进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)验证，显示miRNA-seq与qRT-PCR的一致率达到70%。根据KEGG分析结果构建泛素介导的蛋白水解途径和Notch信号通路的miRNA-mRNA调控网络，结果显示，13个DEmiRNAs分别靶向结合134个与泛素介导的蛋白水解相关的mRNAs和109个与Notch信号通路相关的mRNAs，Aja-miR-184、Aja-miR-2478和Aja-miR-9277p等DEmiRNAs可能参与对Notch信号通路和对泛素介导的蛋白水解的调控。相关研究结果将为刺参疾病发生调控网络建立和机制解析提供依据。

刺参"腐皮综合征"(俗称化皮病)是当前养殖刺参的最主要疾病,死亡率可达90%以上,属急性死亡,越冬保苗期幼参和养成期海参均可被感染发病。经研究证实,灿烂弧菌Vibriosplendidus和假交替单胞菌Pseudoalteromonas nigrifaciens是该病的主要致病原。作者通过漂粉精、溴氯海因、PVP-I、过氧化氢、双链季铵盐络合碘和生石灰6种消毒剂对灿烂弧菌和假交替单胞菌的定性杀灭实验发现,上述6种药物对腐皮综合征的病原菌都有明显的杀灭作用。