为探讨病原菌胁迫刺参(Apostichopus japonicus)基因组DNA甲基化水平和转录组表达的差异，本研究采用人工攻毒侵染胁迫，获得刺参化皮体壁组织，并以未攻毒组的健康体壁组织为对照，对刺参2种体壁组织进行全基因组甲基化测序(WGBS)和转录组高通量测序，解析刺参体壁基因组DNA甲基化差异，筛选响应病原胁迫的差异甲基化区域和差异表达基因。同时，通过基因组甲基化和转录组联合分析，筛选负相关关联基因，为解析刺参响应灿烂弧菌(Vibrio splendidus)侵染的分子机理提供基础数据。结果显示，刺参对照组和侵染组基因组总甲基化水平分别为(3.59±0.04)%和(3.87±0.27)%，侵染组甲基化水平显著升高；在发生甲基化的位点中，攻毒组和对照组的mCpG占比分别为83.06%和81.91%，mCpG为最主要的甲基化形式。本研究共筛选出DMRs 626，677个，注释到23，706个功能基因。转录组测序共检测到29，290个基因，筛选到差异表达基因496个，其中，上调基因214个，下调基因282个。在基因组甲基化与转录组的关联分析中，筛选到180个负相关关联基因，其中，差异甲基化区域位于启动子区域的负相关基因为60个。对负相关关联基因的GO和KEGG富集分析，筛选到相关通路和LRR、hsp20和CARD等关键基因。本研究将为解析刺参抗病的表观遗传调控机制提供基础数据，也有助于为刺参抗病性状选育提供科学参考。

microRNA参与基因的转录后调控，在真核生物的生长发育、细胞分化和免疫防御等过程中发挥重要作用。刺参(Apostichopus japonicus)病害问题已成为产业发展的主要限制因素之一，而其病害发生的分子机制尚待进一步完善。本研究以刺参重大疾病“腐皮综合征”的重要致病原灿烂弧菌(Vibrios splendidus)为侵染菌株，通过人工侵染实验制备患病刺参样本，采用miRNA-seq技术对侵染组(PT16S)和对照组(PT10H)各3头刺参的体壁组织进行miRNA测序，通过相关生物信息学软件对miRNAs进行鉴定和分析，筛选差异表达miRNAs (DEmiRNAs)并预测其靶基因，构建关键调控途径的miRNA-mRNA调控网络。测序结果显示，PT10H组平均得到5 902 588条有效序列，194个已知miRNA和19个新的miRNA；PT16S组平均得到5 053 529条有效序列，182个已知miRNA和42个新的miRNA。对2组鉴定到的miRNA进行差异表达分析，共筛选到2个上调和11个下调的具有显著差异的DEmiRNAs (P≤0.05)，上调的DEmiRNAs靶基因预测结合到3010个靶基因，注释到585个GO terms以及24条代谢通路(P≤0.05)，下调的DEmiRNAs靶基因预测到19 072个靶基因，注释到514个GO terms以及22条代谢通路(P≤0.05)。对筛选到的DEmiRNAs进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)验证，显示miRNA-seq与qRT-PCR的一致率达到70%。根据KEGG分析结果构建泛素介导的蛋白水解途径和Notch信号通路的miRNA-mRNA调控网络，结果显示，13个DEmiRNAs分别靶向结合134个与泛素介导的蛋白水解相关的mRNAs和109个与Notch信号通路相关的mRNAs，Aja-miR-184、Aja-miR-2478和Aja-miR-9277p等DEmiRNAs可能参与对Notch信号通路和对泛素介导的蛋白水解的调控。相关研究结果将为刺参疾病发生调控网络建立和机制解析提供依据。

【目的】探讨荣昌猪基因组DNA甲基化水平随生长发育阶段和组织类型不同而变异的规律。【方法】采用HPLC法分别检测了荣昌猪阉公猪心脏、肝脏、半膜肌3种组织在10,20,35,50,80和100 kg体质量阶段基因组DNA的甲基化水平,分别以体质量和组织类型为影响因素进行单因素方差分析。【结果】与10 kg体质量阶段的基因组DNA甲基化水平相比,3种组织基因组DNA甲基化水平均随个体体质量的增加而呈下降趋势,但不同组织下降的幅度不同:心脏基因组DNA甲基化水平在35 kg时开始明显下降(P<0...

以‘中宁强’核桃品种成熟叶片为材料,采用优化的MSAP反应体系,在全基因组水平对核DNA进行甲基化修饰位点分析,结果表明:选用20对引物组合,共扩增出1 060条清晰、重复性好的谱带,平均每对引物扩增出53条谱带,其中,甲基化位点241个,甲基化修饰比例为22.73%。对部分核桃DNA甲基化修饰位点进行回收测序,得到10条存在DNA甲基化修饰的DNA序列,BLASTn分析表明,核桃基因组中多种类型的DNA序列存在甲基化修饰现象。

以经过连续多代抗寒选育获得的尼罗罗非鱼耐寒品系为实验材料,采用DNA甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)分析方法从全基因组水平上探讨了低温适应对罗非鱼DNA序列中CCGG位点的甲基化水平的影响。结果显示,选用的18对选择性扩增引物共检测到849个位点。耐寒品系检测到的位点数为411个,对照组为438个,其中发生甲基化的位点数分别为72和104个,总甲基化率分别为17.52%和23.74%;全甲基化位点分别为37个和65个,全甲基化率分别为9.00%和14.84%;半甲基化位点分别为35个和39个,半甲基化率分...

[目的]基于RNA-Seq测序技术，初步探究了杨树-腐皮镰刀菌互作过程中相关基因的表达、主要信号通路和代谢途径，筛选了杨树防御腐皮镰刀菌侵染的关键基因，为进一步揭示此类病害的分子机制奠定基础。[方法]以生长2个月的银腺杨84K为材料，用1×10~7个·mL~(-1)的腐皮镰刀菌孢子液侵染根系，于侵染0h（对照组）、48 h和72 h（接菌组）后取根组织进行转录组测序，挖掘杨树响应腐皮镰刀菌侵染的相关基因。[结果]（1）与对照组0 h相比，侵染48 h和72 h分别检测到8 939个和8 246个DEGs(Differentially Expressed Genes)。（2）GO分析发现，差异表达基因主要富集在单一生物体过程、对刺激反应、碳水化合物代谢、生物调节和对激素响应等过程。（3）KEGG分析表明，糖酵解/糖异生、碳代谢、植物激素信号转导和苯丙烷生物合成等途径在病原菌侵染后发生显著变化。（4）杨树糖转运蛋白SWEETs家族中21个成员的表达受腐皮镰刀菌侵染诱导。乙烯受体ETR、乙烯信号通路主要基因EIN3、ERF1、ERF2上调表达，木质素合成关键酶基因CCR、4CL、C3'H、COMT表达量显著升高。[结论]杨树可能通过调节体内糖代谢和转运，激活乙烯信号通路，促进木质素积累、细胞壁增厚等策略，响应腐皮镰刀菌的侵染。

为分析红麻不育系中甲基化模式,以红麻不育系UG93A和保持系UG93B为试验材料,分别提取2个材料的苗期叶片、四分体时期和双核期花药的基因组DNA(gDNA),采用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析比较其不同生长发育时期基因组DNA甲基化的变化规律,并研究甲基化变化基因的表达模式。结果表明:1)红麻生长发育过程中基因组DNA甲基化呈现一定的时空动态变化规律,不育系UG93A和保持系UG93B苗期叶片的甲基化率分别为56.79%(全甲基化率为44.25%,下同

低温压力会导致鱼类生理功能失调、机体损伤甚至死亡,鱼类会产生各种适应性变化来应对低温压力,其中涉及的表观遗传学机制越来越受到重视。为了探讨鱼类低温应激压力下的表观遗传学调控机制,本研究对斑马鱼(Daniorerio)胚胎成纤维细胞ZF4进行短期低温胁迫(18℃处理3d、5d和10℃处理3d、5d)和长期低温胁迫(18℃处理30 d),然后用具有不同甲基化敏感性的同裂酶HpaⅡ和MspⅠ对细胞基因组DNA进行酶切以监测细胞基因组DNA甲基化水平变化。结果显示短期低温胁迫下ZF4细胞生长受到抑制甚至死亡,而经过长期低温胁迫的ZF4细胞对低温压力产生了一定适应性。并且低温胁迫下DNA甲基化水平呈现动态变化,短期低温培养细胞的基因组DNA甲基化水平明显增高,但是长期低温培养细胞的DNA甲基化水平反而下降。此外,研究发现抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)或者共济失调–毛细血管扩张突变蛋白(ataxia telangiectasia mutated,ATM)抑制剂KU-55933可以抑制18℃5 d低温处理后的ZF4细胞DNA甲基化水平的增高,说明活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生和ATM的激活介导了DNA甲基化水平的增高。本研究结果显示,短期低温刺激下ZF4细胞ROS的产生导致DNA损伤,激活DNA损伤修复机制,进而导致基因组DNA甲基化水平上升,该研究为后期斑马鱼低温胁迫分子机制的研究奠定基础。

硫酸软骨素在生物体应对病毒和细菌感染中起着重要作用,为研究硫酸软骨素合酶1(chondroitinsulfate synthase-1, ChSy-1)在仿刺参(Apostichopus japonicus)受到灿烂弧菌(Vibrio splendidus)感染后的作用,本研究开展了仿刺参ChSy-1基因(AjChSy-1)全长序列克隆和结构及系统进化分析,并采用荧光定量PCR技术测定了该基因在刺参不同组织中的表达差异及灿烂弧菌感染下的表达模式。结果显示,AjChSy-1基因cDNA全长为2756bp,其中,5′-UTR长度为194 bp, 3′-UTR为228 bp, ORF为2334 bp,编码777个氨基酸。AjChSy-1基因编码的蛋白含有糖基转移酶保守性DXD基序、β3-糖基转移酶基序及β4-糖基转移酶基序等结构。刺参基因组比对发现在chr13染色体上存在2个AjChSy-1基因拷贝。系统进化分析表明,刺参AjChSy-1编码蛋白与玉足海参(Holothurialeucospilota)和棘冠海星(Acanthaster planci)的蛋白亲缘关系较近,与斑马鱼(Danio rerio)、智人(Homo sapiens)等脊椎动物的蛋白亲缘关系较远。荧光定量PCR显示, AjChSy-1基因具有广泛的组织表达特性,其中,体腔细胞中表达量最高,体壁、性腺(雄性和雌性)和纵肌次之。在响应灿烂弧菌侵染过程中,随灿烂弧菌侵染时间增加,体壁中AjChSy-1表达量呈现先上升后下降的趋势,在第3、6、9天分别为对照组的1.79、2.06、3.12倍,对发病期抗病群体和易感群体中该基因的检测结果表明,易感群体体壁该基因表达量显著低于抗病群体(P<0.05),表达量降低11.4%。推测该基因可能在刺参应对灿烂弧菌中发挥免疫防御作用,相关研究结果为解析刺参AjChSy-1基因功能以及抗病分子调控机制提供了参考数据。

为探讨干露胁迫对海产贝类基因组DNA甲基化的影响,应用荧光标记甲基化敏感扩增多态性(fluorescencelabeled methylation sensitive amplified polymorphism,F-MSAP)技术,比较了不同干露条件下(0 d、0.5 d、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d和11 d)长牡蛎(Crassostrea gigas)基因组DNA甲基化的变化。结果表明,对照组(干露处理0 d)闭壳肌与鳃组织的总体甲基化水平分别为29.76%和29.82%;干露处理0.5

通过甲基化敏感多态性扩增（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ｍｓａｐ）技术，检测马氏珠母贝（ｐｉｎｃｔａｄａ ｍａｒｔｅｎｓｉｉ）外套膜的边缘膜区（ｍａｎｔｌｅ ｅｄｇｅ，ｍｅ）、套膜区（ｍａｎｔｌｅ ｐａｌｌｉａｌ，ｍｐ）和中央膜区（ｍａｎｔｌｅ ｃｅｎｔｒａｌ，ｍｃ）的基因组ｄｎａ甲基化修饰水平；回收具特异性的清晰甲基化修饰片段进行测序、比对分析并筛选基因；利用荧光定量ｐｃｒ对筛选基因进行定量分析。结果显示：（１）利用１５对引物进行扩增实验，平均每个个体外套膜３个区域能够产生（１１６３．２５±１２４．３４）条清晰可辨的条带，其．．．

首次使用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术分析两种小麦材料近等基因系TcLr19及其感病亲本Thatcher的甲基化水平,同时比较了苗期接种叶锈菌生理品种THTT前后基因组DNA胞嘧啶甲基化模式。60对选扩引物对接种前后的小麦DNA进行全基因组筛选,共得到3 554个片段。其中998个片段是两种甲基化模式中的一种,小麦近等基因系TcLr19及其感病亲本Thatcher的甲基化水平约为28.1%。在所有的引物中,并没有直接分离得到接菌前后的甲基化模式的差异。结果初步表明,叶锈菌可能并没有诱导植物基因组DNA胞嘧啶位点的甲基化模式变化。

【目的】通过生理指标和高通量转录组数据解析杨树响应病原菌侵染的分子机制，为探究杨树叶片在胶孢炭疽菌侵染下生理及分子响应模式奠定重要的理论基础。【方法】以毛白杨无性系LM50为试验材料，对胶孢炭疽菌侵染后3种抗氧化酶活性（多酚氧化酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶）变化模式进行分析；基于RNA高通量测序技术分析关键基因及其表达模式。【结果】病原菌侵染叶片6 d后，丙二醛含量和3种抗氧化酶的活性显著提高。共检测到4 547个杨树差异表达基因，其中2 262个基因上调，2 285个基因下调，差异基因主要富集到糖类、脂类、次生代谢产物、苯丙烷、谷胱甘肽、多种氨基酸、不饱和脂肪酸合成及代谢等生物学通路。WRKY、ERF等转录因子家族表达量明显改变，可能在杨树响应病原菌胁迫过程中发挥了重要作用，其中27个WRKY和23个ERF转录因子表达明显受到激活。MapMan分析结果表明病原菌侵染导致氧化胁迫的产生，植物激素含量也增加，这些激素作为信号激活防御反应，最终诱导大量抗病通路相关基因表达。【结论】27个WRKY和23个ERF转录因子可能在杨树响应病原菌胁迫的过程中起到重要的调控作用，谷胱甘肽、苯丙烷和类黄酮次生代谢通路可能参与杨树响应胶孢炭疽菌侵染过程。

【目的】柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是制约柑橘产业发展的重大病害,我国发生的黄龙病由韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)引起。本研究通过分析潜在耐黄龙病柑橘品种马蜂柑(Citrus hystrix)在感染黄龙病后不同时期的生物学症状、显微结构和转录组学差异,揭示马蜂柑不同时期对黄龙病菌具有耐性的分子机理,为进一步深入挖掘抗性基因及开展抗病育种打下基础。【方法】以嫁接在两年生卡里佐枳橙砧木上的马蜂柑作为供试材料,使用只感染CLas、其他常见柑橘病毒类病原均呈阴性的毒源为接毒材料对马蜂柑进行接种,并在接种毒源后每隔15 d进行定期的荧光定量PCR检测。将马蜂柑接种毒源4个月(最早检测到CLas阳性)作为感病前期处理,接种毒源14个月作为感病后期处理,以健康植株为对照,进行生物学症状和显微结构观察,分析其感病后不同时期的结构变化。结合比较转录组学分析与荧光定量PCR验证,解析其耐病相关机制。【结果】症状观察发现,马蜂柑在感病前期和感病后期,植株叶片几乎不显症;显微结构观察表明,马蜂柑在感病前期中脉组织结构清晰,细胞形态正常,无淀粉粒积累的现象,仅在后期出现韧皮部极少数的筛管被堵塞;对转录组测序结果进行筛选鉴定,马蜂柑感病前期共筛选鉴定到181个差异表达基因,感病后期共筛选鉴定到1 384个差异表达基因;比较转录组分析表明,马蜂柑感病前期和后期的差异表达基因主要涉及细胞壁代谢、防御反应、淀粉与蔗糖代谢、胼胝质合成以及信号转导等方面,其中在感病前期,淀粉与蔗糖代谢、细胞壁代谢相关的调控基因下调表达,在感病后期,水杨酸代谢及其信号转导途径、病程相关蛋白和谷胱甘肽转移酶相关的调控基因上调表达。【结论】马蜂柑响应CLas早期侵染主要表现为物理结构稳定、淀粉合成和光合作用等途径不受干扰;而水杨酸介导的抗性信号转导、效应蛋白触发免疫反应(effector-triggered immunity,ETI)激活的病程相关蛋白和谷胱甘肽转移酶参与的解毒作用是感病后期的主要耐病机制。

【目的】探究不同盐胁迫后的棉花基因组DNA甲基化变化情况,并比较分析叶片和根部DNA甲基化变化差异,进而探究DNA甲基化与棉花耐盐性之间的关系。【方法】以陆地棉耐盐品种中9806和盐敏感品种中S9612为试验材料,分别用NaCl和Na2CO3(浓度均为0.4%)处理。提取对照和处理材料的DNA,进行双酶切、连接、预扩增和选择性扩增,然后采用MSAP技术(甲基化敏感扩增多态性)分析棉花幼苗在盐胁迫前后的DNA甲基化情况。从聚丙烯酰胺凝胶中回收纯化多态性片段并进行测序,通过NCBI进行比对分析;设计引物,用实时荧光定量PCR对多态性片段在棉花幼苗中的表达量进行验证。【结果】盐胁迫分析表明不同类型盐...