【目的】由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的菌核病是我国油菜种植上的主要问题,严重威胁着菜籽产量及品质。分泌性蛋白在病原菌致病过程中起着重要作用,核盘菌基因组中包含大量编码分泌性蛋白的基因,本研究旨在鉴定并筛选与致病性相关的分泌蛋白基因,揭示核盘菌的致病机理,为菌核病防控提供重要靶标。【方法】采用SMART软件对核盘菌在侵染抗病、感病甘蓝过程中差异表达明显的8个具有信号肽的候选基因进行蛋白质结构域的分析,随后将SMART分析得到的结构域分别于SCOP、Pfam、PDB数据库进行功能注释。利用基因特异性引物进行目的基因特异片段的PCR扩增,构建pTRV2-Gene和pTRV2-GFP载体。随后等量混合含有pTRV1及pTRV2-Gene,pTRV1及pTRV2-GFP载体的重悬菌液。室温静置3 h后,利用针筒浸润法将pTRV2-Gene载体及对照(TRV-GFP)侵染5—6周龄的本氏烟(Nicotiana benthamiana)。侵染植株于黑暗环境中培养48 h后,再置于正常光照条件的环境中生长7 d。将直径6 mm的核盘菌PDA菌丝块接种于侵染9 d后的烟草叶片叶腹的中央,其中带菌面紧贴叶片,随后将接种植株培养48 h后统计病斑面积。提取接种48 h后的病斑及病斑周围组织叶片(距腐烂组织边缘1 cm左右)的RNA,利用特异引物进行目的基因的qRT-PCR,计算目的基因在携带TRV-HIGS载体的烟草植株中的相对表达量。【结果】SMART及结构域注释预测这8个候选基因可能参与了蛋白、核酸或多糖的水解,影响植物的免疫反应,参与核盘菌对药物耐受性的调节及生物素合成。核盘菌接种携带这8个基因的TRV-HIGS载体及对照载体的烟草,48 h后对照植株的病斑面积平均为3.44 cm~2,除SS1G_07655外,其余7个候选基因的TRV-HIGS植株上的病斑面积相比对照植株均显著减小(P≤0.05),其病斑面积介于1.63—2.61 cm~2。qRT-PCR结果显示,这7个致病相关的候选基因在核盘菌侵染烟草过程中的基因表达水平均显著低于对照(P≤0.05)。【结论】利用TRV介导的HIGS技术成功地对核盘菌中8个未知功能的分泌蛋白基因进行了功能鉴定,筛选到7个可能与核盘菌致病性相关的基因,其中对核盘菌致病性影响最大的SS1G_03146预测可能参与核盘菌生物素合成,同时SS1G_04343及SS1G_11912预测可能参与影响植物的免疫反应。

在调查核盘菌和三叶草核盘菌发生为害的基础上，以核盘菌菌株Ｒａｐ－１和三叶草核盘菌菌株ＣＭＶ－２为代表，比较了温度及降雨等因子对菌丝生长及菌核萌发的影响。在１５～２８℃下Ｒａｐ－１菌丝生长较ＣＭＶ－２快，但在８℃下则相反；Ｒａｐ－１菌核在自然条件下萌发期间的温度较ＣＭＶ－２菌核萌发时温度高，两者菌核萌发呈现出明显的先后秩序。春季降雨的波动导致２种核盘菌的菌核萌发出现波动。离体致病性测定结果表明，核盘菌的致病性明显强于三叶草核盘菌。

【目的】水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)的hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因编码形成的Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS),将致病性效应分子注入水稻细胞中,但Xooc的hrcJ基因在致病性中的作用以及其如何参与形成T3SS分泌装置,并不明确。【方法】本研究根据标记交换原理对Xooc的hrcJ基因进行了敲除。【结果】发现hrcJ突变体丧失在水稻上的致病性和在烟草上的HR激发能力。酵母双杂交显示,HrcJ蛋白N端脂蛋白结构域可与HrcC互作,HrcJ...

寨卡病毒(Zika Virus)属于黄病毒科中的黄病毒属,虽然很早就已经被人类所发现,但是一直到2015年在南美巴西的大规模爆发,才引起了广泛的关注.寨卡病毒对人类的感染往往引起包括小头畸形和格林-巴利综合征在内的多种症状.寨卡病毒的基因组为单链正链RNA,其基因组可以编码翻译并剪切加工出3个结构蛋白,分别为膜蛋白,囊膜蛋白和核衣壳蛋白,以及7个非结构蛋白(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5).相关研究已经证明,NS1蛋白与同属黄病毒属的登革病毒的发病有紧密的联系,而且根据其蛋白结构推测其可能与寨卡病毒穿越血脑屏障有关.因此鉴别NS1与细胞内的相互作用蛋白对于发现寨卡病毒在细胞内的转运,转录,以及装配都有重大的意义.在此,该课题构建并在HEK293细胞中表达包含Flag和Strep两种标签的NS1融合蛋白,通过免疫沉淀的方法将与NS1结合的蛋白利用标签蛋白进行分离,利用高分辨生物质谱技术,对蛋白进行分析鉴定.通过分别带有Flag与Strep标签的相互作用蛋白分析,发现了16个两种标签共同的结合蛋白,其进一步的通路分析证明这些蛋白于与病毒转录、病毒复制和免疫反应多个通路有关,相关的研究结果为今后进一步研究寨卡病毒的复制机制以及开发抗病毒药物提供了重要的参考价值.

为探究沙门菌外膜蛋白基因fadL、ompN、ybfM以及sRNA RybB和伴侣蛋白Hfq缺失对该菌致病性的影响，构建了鼠伤寒沙门菌基因缺失菌株，并测定了基因缺失菌株的生长曲线，同时通过小鼠腹腔注射测定了基因缺失菌株的毒力及其在小鼠脾脏和肝脏上的定殖能力.结果显示，与鼠伤寒沙门菌亲本野生型菌株LT2相比，基因缺失菌株的生长能力变化不大.LT2对小鼠的LD_(50)为3.97×10~7 CFU;外膜蛋白基因缺失菌株ΔompN、ΔfadL和ΔybfM的LD_(50)分别为1.58×10~5、6.29×10~5、9.97×10~5 CFU,毒性明显增强；sRNA敲除菌株(ΔrybB)的LD_(50)为9.97×10~7 CFU,毒性有所下降；伴侣蛋白Hfq敲除组(Δhfq)及rybB&hfq双敲除组的小鼠死亡数未超过50%,毒性明显下降.感染48 h后，与对照组(LT2)相比，所有基因缺失菌株处理组的脾脏指数均极显著性升高；ΔrybB&Δhfq、Δhfq处理组的脾脏载菌量显著降低，其余菌株处理组的载菌量与LT2差异不显著；ΔrybB、ΔrybB&Δhfq、ΔfadL、ΔybfM处理组的肝脏指数均显著下降，而Δhfq、ΔompN处理组的肝脏指数变化不显著；ΔrybB、ΔfadL处理组肝脏载菌量变化不显著，Δhfq、ΔrybB&Δhfq处理组的肝脏载菌量显著下降，而ΔompN、ΔybfM处理组的载菌量显著上升.总的来说，hfq、rybB缺失降低了鼠伤寒沙门菌的致病力，而fadL、ompN、ybfM的缺失提高了鼠伤寒沙门菌的致病力.

【目的】筛选菊花中抗白锈病相关基因,研究菊花抗白锈病的分子机理。【方法】以菊花中对白锈病完全免疫的品种‘紫荷’为供试材料,对其叶片喷施106个白锈病冬孢子/mL蒸馏水,处理时间梯度为0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h,使用cDNA-AFLP技术分析这一接种过程中的差异表达基因,并采用RT-PCR方法对表达结果进行验证。利用RACE技术克隆其中重要蛋白基因的cDNA全长,采用MEGA 4.0程序进行序列分析。【结果】利用76对引物组合,共筛选出了约4 950条差异表达的cDNA片段,对其中80个表达差异显著的片段进行测序,最终得到51个差异片段的核苷酸序列。...

为进一步了解柑橘黄龙病菌亚洲种Clas的致病机理，从Prasad预测的166种分泌蛋白中选取1个在柑橘植株中表达量较高的CLIBASIA–04580基因进行研究。提取感染柑橘黄龙病的柑橘叶片总DNA，经 PCR扩增得到 CLIBASIA–04580基因，切胶回收PCR产物双酶切连接到pET–28a载体上，使用菌落PCR和限制性内切酶双酶切鉴定筛选阳性克隆；转化大肠杆菌 BL21(DE3)，使用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导重组蛋白表达融合组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白，聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS–PAGE)检测重组蛋白的表达水平，然后使用蛋白纯化镍柱进行纯化。结果表明，携带组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白得到表达，且异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为1.5 mmol/L时相对表达量达到峰值，通过SDS–PAGE凝胶分析，与未经过镍柱纯化的蛋白原液比较可知成功纯化了CLIBASIA–04580重组蛋白。

为进一步了解柑橘黄龙病菌亚洲种Clas的致病机理，从Prasad预测的166种分泌蛋白中选取1个在柑橘植株中表达量较高的CLIBASIA–04580基因进行研究。提取感染柑橘黄龙病的柑橘叶片总DNA，经 PCR扩增得到 CLIBASIA–04580基因，切胶回收PCR产物双酶切连接到pET–28a载体上，使用菌落PCR和限制性内切酶双酶切鉴定筛选阳性克隆；转化大肠杆菌 BL21(DE3)，使用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导重组蛋白表达融合组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白，聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS–PAGE)检测重组蛋白的表达水平，然后使用蛋白纯化镍柱进行纯化。结果表明，携带组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白得到表达，且异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为1.5 mmol/L时相对表达量达到峰值，通过SDS–PAGE凝胶分析，与未经过镍柱纯化的蛋白原液比较可知成功纯化了CLIBASIA–04580重组蛋白。

以提纯的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶 (ECPase)注射异育银鲫 ,鲫鱼出现典型的由嗜水气单胞菌引起的败血症症状 :病鱼体表充血、出血 ,鳃苍白 ,腹部膨大 ,肛门红肿突出 ,腹腔内有红色的腹水 ,肠壁充血发炎 ;背部肌肉注射部位发生液化、糜烂 ,鳞片竖起。病鱼各组织器官都有病变 ,其中尤以肝、肾最为严重 :肝脏肿大 ,质地脆弱 ,肝细胞水肿 ,胞浆结构疏松 ;肾小体坏死以至解体 ,肾小管上皮细胞也发生病变。体外试验表明 ,正常鲫鱼血清中有某种成分能够抑制蛋白酶的活性

为了探明拟态弧菌OmpU蛋白的黏附功能,利用同源重组技术敲除基因组中OmpU基因,并构建其互补株,再经组合PCR方法和序列测定,证实了OmpU基因的缺失和互补。对野生株、缺失株和互补株进行了遗传稳定性、生长特性、生化特性、细胞黏附性、致病性等方面比较研究。结果显示,缺失株具有遗传稳定性;在相同的培养条件下,与野生株相比,突变株的培养特性和生化特性没有明显变化,生长速率略减慢,对实验草鱼的毒力降低了4倍,对鲤上皮瘤细胞(EPC)的黏附能力显著降低,下降了66.6%,而互补株的黏附能力和毒力又得到恢复,与野生株无明显差异。研究首次确证了拟态弧菌OmpU蛋白具有黏附功能,OmpU蛋白通过黏附参与致病...

【目的】以水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)编码的NSvc4蛋白和CP蛋白的致病功能鉴定为切入点,研究RSV的致病机理。【方法】通过农杆菌介导在本氏烟中对RSV编码的6个蛋白进行细胞定位。采用双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)技术鉴定NSvc4蛋白与其余5个蛋白间的互作关系,并用酵母双杂交体系(Yeast two-hybrid,YTH)对NSvc4与CP蛋白间的互作再次验证。利用马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)系统在本氏烟叶片研究NSvc4蛋白和CP蛋白的致病性,采用实时荧光定...

wxocA、wxocB、wxocD、wxocE和wzt是水稻条斑病菌(Xanthom onas oryzaepv.oryzicola,Xooc)的脂多糖(lipopo-lysaccharide,LPS)合成基因,avrXa3是水稻白叶枯病菌(Xanthom onas oryzaepv.oryzae,Xoo)的一个无毒基因。利用pBCSK(-)和pKNG101两个质粒的复制起点不被水稻黄单胞菌识别的特点,把wxocA、wxocD、wxocE和wzt的中心区域克隆在pBCSK(-)上,获得突变转化单元pBCSK∷ΔwxocA、pBCSK∷ΔwxocD、pBCSK∷ΔwxocE和pBCSK∷Δwzt...

为探讨广西南宁市、浦北县和玉林市暴发性死亡胡子鲶的病原菌及其所携带６种毒力基因对其致病力的影响，用常规方法从病鱼的心脏、肝脏等部位分离细菌，人工感染实验确定病原菌的致病性，以ＡＰＩ ２０ＮＥ生化鉴定和１６Ｓ ｒ ｒＮＡ分子鉴定相结合的方法对病原菌进行鉴定，采用ＰＣｒ扩增法检测病原菌的６种毒力基因携带情况。结果显示，从患病鱼中共分离到５株病原菌，其中嗜水气单胞菌３株，温和气单胞菌２株。３株嗜水气单胞菌与标准菌株ＡＥｒｏｍｏＮＡＳ ｈｙｄｒｏＰｈＩｌＡ ＡＴＣＣ ７９６６（ＣＰ０００４６２）的亲缘关系最近，相似性均为９９．８％，２株温和气单胞菌与标准菌株ＡＥｒｏｍｏＮＡＳ ＳｏｂｒＩＡ Ｎｏ．１０．．．

【目的】菌核病是由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的一类真菌病害,核盘菌寄主范围广泛,严重危害多种作物的品质。本研究利用寄主诱导基因沉默(HIGS)的方法在寄主中诱导核盘菌致病相关基因的沉默从而增强寄主的菌核病抗性,为菌核病抗病育种提供新的思路。【方法】铜锌超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化剂,以核盘菌铜锌超氧化物歧化酶铜伴侣基因(copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase,SsCCS)为靶基因,通过生物信息学分析该基因的结构特点,并利用MEGA6.0软件构建系统发育树;通过分别比对拟南芥及核盘菌基因组,选择特异的干扰片段进行扩增;采用农杆菌介导的浸花序法,将HIGS载体转入拟南芥Col-0,通过DNA鉴定以及标记筛选出稳定的HIGS-CCS转基因拟南芥;选取4—5周龄的HIGS-CCS转基因拟南芥植株叶片接种核盘菌野生菌株1980,于接种24 h后统计病斑面积,分析转基因株系的菌核病抗性;通过qRT-PCR分析核盘菌侵染转基因植株过程中SsCCS的表达情况;同时在接种6、12、24 h后利用DAB染色的方法检测转基因植株与核盘菌互作过程中H2O2的积累。【结果】生物信息学分析结果表明,SsCCS(SS1G_00102)全长为1 010 bp,编码序列长759 bp,共编码253个氨基酸,该蛋白分子质量为27 176.96 Da,等电点(PI)为5.04,与灰霉病菌BcCCS(EDN25358)亲缘关系最近,氨基酸同源性达到87%,与拟南芥AtCCS(AT1G12520.1)亲缘关系较远;通过与核盘菌以及拟南芥基因组比对,选择314 bp特异干扰片段,成功构建SsCCS的HIGS表达载体,转化拟南芥。T1及T2代转基因拟南芥接种核盘菌24 h后的病斑面积均小于野生型拟南芥。从T2代中获得3个稳定表达的T3代HIGS-CCS转基因拟南芥株系:HIGS-CCS-5、HIGS-CCS-8、HIGS-CCS-13;与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥在接种核盘菌24 h后,病斑面积显著减小46%—61%;qRT-PCR结果显示核盘菌在侵染转基因植株过程中,SsCCS的表达量显著低于侵染野生型拟南芥。DAB染色结果表明,在侵染过程中,转基因拟南芥植株中H2O2的积累明显少于野生型拟南芥,ROS水平降低。【结论】利用HIGS方法在拟南芥中干扰核盘菌SsCCS的表达能够显著提高拟南芥的抗病性,研究结果为油菜等农作物菌核病抗病改良提供了参考。