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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
白玉 许晓东
【目的】利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选建立苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子lef10点突变载体，为进一步研究AcMNPV lef10的功能提供参考。【方法】 利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选BAC修饰系统对AcMNPV lef10进行点突变，由于lef10和必需基因vp1054有重叠，所以在敲除lef10时只能通过引进点突变使lef10失活，避免影响vp1054的正常表达。首先，构建rpsLAMP筛选盒，然后在野生型AcBacmid中引进点突变，方法是通过2次Red/ET重组：第1次重组在野生型AcBacmid lef10中引进rpsLAMP抗性筛选标记...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
白玉 许晓东
【目的】利用Ｒｅｄ／ｅＴ系统结合ＲｐｓＬ反向筛选建立苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＭＮｐＶ）晚期表达因子Ｌｅｆ－１０点突变载体，为进一步研究ＡｃＭＮｐＶＬｅｆ－１０的功能奠定基础。【方法】利用Ｒｅｄ／ｅＴ系统结合ＲｐｓＬ反向筛选ＢＡｃ修饰系统对ＡｃＭＮｐＶ Ｌｅｆ－１０进行点突变，由于Ｌｅｆ－１０和必需基因Ｖｐ１０５４有重叠，所以在敲除Ｌｅｆ－１０时只能通过引进点突变使Ｌｅｆ－１０失活，避免影响Ｖｐ１０５４的正常表达。首先，构建ＲｐｓＬ－ＡＭｐ筛选盒，然后在野生型ＡｃＢＡｃＭｉｄ中引进点突变（方法是通过２次Ｒｅｄ／ｅＴ重组：第１次重组在野生型ＡｃＢＡｃＭｉｄ Ｌｅｆ－１０中引进ＲｐｓＬ－ＡＭ．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱孔利 赵钰 蒋向 许晓东
【目的】将已经成功构建的AcMNPVlef-10表达载体在原核和真核表达系统中表达,研究其形成高分子复合物的特性,为揭示其高分子复合物的形成机理奠定基础。【方法】将先前成功构建的pTriEx-lef-10、pTriExlef-10-1-52、pTriEx-lef-10-27-78重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)和Sf 9细胞中诱导表达,产物经纯化、浓缩后,进行SDS-PAGE和Western blot检测分析;利用SDD-AGE技术估测LEF-10蛋白的分子质量;用透射电子显微镜分别观察原核和真核系统表达的LEF-10蛋白的外部形态。【结果】Western blot分析显示,LEF...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘田田 蒋向 许晓东
【目的】研究苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子lef-10在宿主细胞Sf9中的时空表达及定位,为进一步研究lef-10的功能提供理论基础。【方法】利用不同的特异引物,通过PCR方法扩增lef-10及innateP-lef-10目的片段,将目的片段分别克隆到载体pTriEx-SP-GFP上,得到重组质粒pTriEx-lef10-GFP和pTriEx-innateP-lef10-GFP,经过双酶切检测构建载体。将重组质粒分别与Bacmid共转染Sf9细胞,用得到的重组病毒分别于4,8,16,24,36h再次感染宿主细胞;用激光共聚焦显微镜观察lef-10的表达及亚细胞定位情况。...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
彭梅芳 甘凤 潘春梅 宋健兰 范晓丽 陈克贵
【目的】在植物转基因研究中,使用选择标记基因(Selectable Marker Gene, SMG)使得转化子的筛选更准确便利,但存在SMG的转基因植株可能对人类健康及生态环境造成潜在危害,这也限制了转基因植物商业化的应用前景。因此去除转基因植物中的SMG十分必要。【方法】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对水稻转基因中常用的SMG潮霉素抗性基因(hygromycin phosphotransferase II,hptII)设计构建了编辑载体,利用农杆菌(LBA4404)介导的遗传转化方法转化水稻日本晴,得到转化植株,再将转化植株与带有hptII基因的植株进行杂交。【结果】通过遗传转化及分子鉴定,本研究得到了18株可用于编辑hptII基因的转化植株,进一步对转化植株与带有hptII基因的植株杂交的F_1代进行检测,经PCR检测及测序验证表明,在杂交F_1代植株中,hptII基因的DNA确有编辑发生,包括碱基缺失、替换以及插入等,使得hptII基因不能成功转录。【结论】利用CRISPR/Cas9技术,成功获得了删除hptII基因的转基因水稻。这为植物转基因研究实现无选择标记基因(marker-free)奠定了基础。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
原海亮 管仁艳 何璟
为了阐明ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅＳ Ｓａｈａｃｈｉｒｏｉ ａｔｃｃ ３３１５８中Ⅲ型聚酮合酶基因ｏｒｆ１８的功能，利用同源双交换的方法对该基因进行同框敲除，采用异位表达的方法进行了相应的回补实验。通过高效液相色谱及液相色谱－质谱联用分析发现基因ｏｒｆ１８的敲除会明显降低发酵产物中苯甲酸盐的含量，回补该基因能够在一定程度上恢复苯甲酸盐的产量，表明ｏｒｆ１８在原宿主中极有可能参与苯甲酸盐的生物合成。
[期刊] 水产学报
[作者]
赵心愉 刘娟 邹曙明
细胞因子信号传导抑制蛋白1（SOCS1）是一种重要的负反馈调节因子，广泛参与调控多种细胞因子介导的信号通路，在免疫系统的调节和生物体的生长发育过程中都发挥着至关重要的作用。本实验以已获得的团头鲂socs1a和socs1b基因为编辑对象，在线分析筛选出合适的靶点合成gRNA（guide RNA），然后对1～2细胞期的团头鲂胚胎进行gRNA和Cas9蛋白的混合注射。通过荧光定量PCR在转录水平鉴定socs1a和socs1b的表达和测序在DNA水平鉴定基因的序列突变，成功建立了多种socs1的突变品系。与同期野生型（WT）相比，SOCS1a~(+/-)和SOCS1b~(+/-)团头鲂生长性能增强、体质量显著增加，同时炎症因子TNF-α和IL-6表达量显著增加，而IL-1β表达无明显变化。注射嗜水气单胞菌后，与野生型不同的是，IL-6和TNF-α在SOCS1a~(+/-)和SOCS1b~(+/-)团头鲂的肝脏中的表达均有持续显著上升。本实验通过CRISPR/Cas9系统成功敲除了团头鲂socs1a和socs1b基因，为进一步探讨socs1基因的作用提供了一定的研究基础。同时，也为以养殖鱼类为对象，合理选用CRISPR/Cas9基因编辑技术提供了依据和借鉴。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
黄振玉 竹个个 邹华锋 吕为群
细胞周期蛋白M2(CNNM2)是参与体内镁离子平衡的重要候选基因,实验采用的CRISPR/Cas9系统是近几年发展起来的一类新型基因打靶技术。在斑马鱼CNNM2基因的一号外显子处选取打靶位点,构建sgRNA表达载体。随后将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA混合物分别以约30 pg和300 pg的剂量显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中实现对目的靶基因CNNM2的敲除。24~48 h后PCR产物回收,限制性酶切法初步检测基因打靶情况,最后进行测序分析确定突变类型。为进一步验证突变的稳定遗传性,选择了具有敲除效率的F0与野生型斑马鱼进行外交,对获得的F1进行逐一剪尾,提取DNA进行PCR和测序...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
丁修虎 丁强 王悦 夏淑雯 赵芳 陈坤琳 吴家顺 何南 仲跻峰 王慧利 李惠侠
[目的]β-乳球蛋白是由BLG基因编码的蛋白质，是牛乳中主要的过敏原。本试验旨在使用优化后的CBE单碱基编辑器YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因进行单碱基编辑，同时对两种单碱基编辑器在牛胚胎BLG基因敲除效果进行评价。[方法]在奶牛的BLG基因的第一外显子上设计sgRNA序列，通过胞嘧啶碱基编辑器将BLG基因第21位密码子CAG突变为TAG实现c*.61C>T（p.Q21*）的转变，获得终止密码子，使蛋白质翻译提前终止，达到基因敲除的目的。通过体外转录获得sgRNA和YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max的mRNA，显微注射到奶牛胚胎中。收集囊胚进行胚胎基因组扩增，PCR扩增BLG基因目标序列并进行测序验证编辑效率。根据sgRNA的序列，全基因组选择错配碱基最少的5个潜在脱靶位点进行脱靶检测。[结果]分别检测20枚YE1-BE3-FNLS编辑囊胚和24枚YE1-AncBE4max编辑囊胚，PCR测序，YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因的靶向编辑效率为79.17%（19/24）高于YE1-BE3-FNLS的靶向编辑效率60%（12/20），而前者存在较大的编辑窗口，可对sgRNA序列上的多个胞嘧啶进行编辑（C1-C9），后者具有较小的编辑窗口为C2-C4；另外，YE1-BE3-FNLS具有较高的靶位点双链编辑效率35%（7/20），而YE1-AncBE4max只有2枚编辑胚胎发生双链编辑，纯合编辑率较低；经分析，两种单碱基编辑器制备的编辑胚胎均未出现插入缺失和脱靶效应。[结论]本文使用的两种胞嘧啶碱基编辑器均能高效制备奶牛BLG基因编辑胚胎，为进一步获得BLG基因单碱基敲除奶牛储备技术方法。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
黄振玉 竹个个 邹华锋 吕为群
细胞周期蛋白Ｍ２（ＣＮＮＭ２）是参与体内镁离子平衡的重要候选基因，实验采用的ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ９系统是近几年发展起来的一类新型基因打靶技术。在斑马鱼ＣＮＮＭ２基因的一号外显子处选取打靶位点，构建ＳｇＲＮａ表达载体。随后将体外转录的ＳｇＲＮａ和ＣａＳ９ ＭＲＮａ混合物分别以约３０ Ｐｇ和３００ Ｐｇ的剂量显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中实现对目的靶基因ＣＮＮＭ２的敲除。２４～４８ ｈ后ＰＣＲ产物回收，限制性酶切法初步检测基因打靶情况，最后进行测序分析确定突变类型。为进一步验证突变的稳定遗传性，选择了具有敲除效率的Ｆ０与野生型斑马鱼进行外交，对获得的Ｆ１进行逐一剪尾，提取ＤＮａ进行ＰＣＲ和测序．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
韩政宏 段宇轩 徐善斌 王敬国 刘化龙 杨洛淼 贾琰 辛威 郑洪亮 邹德堂
为促进长粒型粳稻品种的选育，以粳稻品种东富139、龙粳31和东农427为试验材料，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA和pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA 2个敲除载体，通过农杆菌转化法侵染受体材料的愈伤组织，对GS3和GS9基因进行定点编辑。最终，3个品种在T_2都获得了GS3单基因突变、GS9单基因突变和GS3、GS9双基因突变，且无T-DNA元件的纯合植株。在成熟期对T_2突变体及其野生型的农艺性状进行考察分析，结果表明，与野生型相比，3个品种的gs3突变植株的粒长、千粒质量均显著增加，粒宽、结实率和穗粒数无显著变化；gs9突变体粒长显著增加，粒宽显著减少，千粒质量、结实率和穗粒数无显著变化；gs3gs9突变体粒长增加，且增幅大于gs3和gs9,同时粒宽显著减少，千粒质量显著增加，而结实率和穗粒数无显著变化。综上，利用CRISPR/Cas9技术对东富139、龙粳31和东农427等3个粳稻品种的粒型进行改良，加快了长粒型粳稻新品种的选育进程。
[期刊] 林业科学研究
[作者]
罗辑 周国英 朱积余
lef-8基因作为杆状病毒重要的早期表达基因,编码病毒RNA聚合酶的最大亚基。本文通过对油桐尺蛾核型多角体病毒lef-8基因进行测序,对其基因结构及其在杆状病毒中的系统进化进行了分析。发现lef-8基因在油桐尺蛾核型多角体病毒中编码区长2 634 bp,编码877个氨基酸。在5’-UTR区具有可能为其启动子及转录起始位点的信号序列,在3’-UTR区具有加尾信号序列,但这些序列的具体功能还有待进一步研究。其蛋白序列与常见的模式NPV同源性较低,但具有共同的签名序列。通过对杆状病毒lef-8基因的系统进化分析,发现颗粒体病毒和核型多角体病毒明显分为两支,而核型多角体病毒中又明显分为4个分支,其进化...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
陈波 闫慧清 李莉 曹海鹏 辛健康 姜山
【目的】为探明PpCASLUU3是否参与灰霉菌引起的小立碗藓中类过敏反应,构建PpCASLUU3-PTN182敲除载体,对早期登陆植物防卫防御的进化提供依据。【方法】根据同源重组的原理,以小立碗藓基因组DNA为模板,利用Primer 5设计的引物,扩增得到小立碗藓PpCASLUU3基因的上、下游同源臂基因片段。将上下游同源臂基因分别克隆到pMD-19T上,测序验证,使用EcoR I、EcoR V酶切含上游目的基因的pMD-19T获得上游目的基因片段,使用BamH I、Sma I酶切含下游目的基因的pMD-19T获得下游目的基因片段,同时酶切PTN182载体,经T_4-DNA连接酶连接,转入大肠杆菌感受态,筛选出阳性克隆,采用相同的方法,将下游臂连入PpCASLUU3.1-PTN182载体。【结果】经PCR检测、酶切验证,获得了完整的PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2敲除载体。经测序分析,插入序列PpCASLUU3.1和PpCASLUU3.2与未插入前相似度分别为100%和99.63%。【结论】PpCASLUU3-PTN182敲除载体构建成功。
[期刊] 华北农学报
[作者]
游雷鸣 罗俊 王爱萍 张改平 卜丹 郭亚男 祈艳华
从鸡B淋巴DT40细胞系中克隆-βactin启动子,替换pCDNA3.1(+)载体中的SV40启动子,构建-βactin启动子驱动的Neomycin抗性基因表达框。将克隆的sIgMλ轻链基因两侧各约2 kb的序列插入到抗性表达框的两侧作为同源臂。PCR、酶切以及测序结果表明成功构建了靶向sIgMλ轻链基因的置换型打靶载体pCDNA-act-neo-HR。为建立sIgMλ轻链基因敲除的DT40细胞模型,探究sIgMλ轻链在IBDV感染DT40细胞过程中的作用奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘来鑫 樊圃
[目的]探究色氨酸羟化酶2(Tph2)基因敲除对雄性大鼠焦虑、抑郁样行为和社交行为的影响,为进一步研究五羟色胺(5-HT)系统对大鼠生长发育及行为的调控机制提供参考。[方法]以SD背景的雄性大鼠为研究对象,采用高效液相色谱串联高分辨质谱检测成年野生型大鼠(WT)和Tph2基因敲除(第6外显子(98 bp)及其前128 bp序列被敲除)大鼠(Tph2~(KO))脑内中缝核5-HT含量;比较10周龄WT和Tph2~(KO)大鼠的体质量;统计旷场试验范式中WT和Tph2~(KO)大鼠进入中心区域的时间、次数,以及高架十字迷宫范式中WT和Tph2~(KO)大鼠进入开放臂和闭合臂的时间、次数,从而判断大鼠的焦虑水平;统计强迫游泳范式中WT和Tph2~(KO)大鼠静止漂浮的时间,评估大鼠的抑郁样行为;统计三室试验范式中WT和Tph2~(KO)大鼠探索陌生同龄同性别大鼠的时间及探索空室的时间,评估大鼠的基础社交水平;统计社交新奇测试范式中WT和Tph2~(KO)大鼠探索陌生大鼠的时间,评估大鼠的社交新奇认知能力。[结果]Tph2~(KO)大鼠大脑中缝核5-HT含量为19.08 nmoL/g,极显著低于WT大鼠大脑中缝核5-HT含量(2 075.00 nmol/g)(P0.05)。高架十字迷宫试验中Tph2~(KO)大鼠探索开放臂的时间为69.89 s,次数为5.40次,与WT大鼠(66.25 s,4.30次)无显著差异(P>0.05)。强迫游泳试验中Tph2~(KO)大鼠静止漂浮的时间(43.92 s)与WT大鼠(27.79 s)无显著差异(P>0.05)。社会互动试验中Tph2~(KO)大鼠社会互动时间为224.00 s,极显著高于探索空室的时间(12.57 s)(P0.05);WT大鼠探索陌生鼠2的时间为124.00 s,极显著高于探索陌生鼠1的时间(69.88 s)(P<0.01)。[结论]Tph2基因敲除导致雄性大鼠大脑中缝核5-HT含量显著降低,体质量和社交新奇认知能力均显著降低。
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