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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵文军 朱水芳 夏明星 陈红运
[期刊] 华北农学报
[作者]
李欣 崔秀明 刘迪秋 孙恬 郭爱玲 陈军
为了建立一种准确、快速检测三七根腐病病原真菌尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR方法,基于尖孢镰刀菌脂肪酸ω-羟化酶基因设计了实时荧光定量PCR的特异性引物对Fo-QF和Fo-QR,制备了该基因的重组质粒标准品,建立了尖孢镰刀菌的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。从三七种植区采集到14个具有根腐病、黑斑病典型症状的三七病株及三七种植土壤样品,并提取了这些样品的总DNA,运用本研究建立的荧光定量PCR方法进行了检测。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法特异性强,脂肪酸ω-羟化酶基因只以尖孢镰刀菌DNA为模板扩增出特异的PCR产物。此外,该方法灵敏度高,检测模板浓度可低至0. 35 pg/μL。构建的荧光定量PCR标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,扩增效率好。利用该定量检测体系,能从几种不同的三七病株中快速检测出携带尖孢镰刀菌的根腐病病株,从而达到准确诊断的目的。本方法不仅能明确三七种植土壤以及三七病株中尖孢镰刀菌数量的动态变化,并且可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及带病三七种子、种苗的快速分子检测提供技术支持。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郑新添 黄翠琴 黄其春 戴爱玲 谭晓珺
【目的】建立检测胞内劳森菌的ＳＹＢＲ ＧＲｅｅｎⅠＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法，为猪增生性肠炎的准确诊断奠定基础。【方法】针对胞内劳森菌１６ＳＲＤｎａ序列设计引物，扩增１６ＳＲＤｎａ，构建Ｐｔ－ｌｉ－１６Ｓ重组质粒。以Ｐｔ－ｌｉ－１６Ｓ为模板建立检测胞内劳森菌的ＳＹＢＲ ＧＲｅｅｎⅠＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法，检测其特异性、敏感性和重复性，并用该方法对５１份疑似增生性肠炎病例进行检测。【结果】建立的ＳＹＢＲ ＧＲｅｅｎⅠＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法特异性强，与大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和副猪嗜血杆菌等无交叉反应；在标准质粒含量为１．０×１０２～１．０×１０８拷贝／μｌ时，质粒含．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
翟晓虎 李翎旭 陈小竹 蒋怀德 贺卫华 姚大伟
【目的】建立一种快速、准确的肉中猪源性成分定量检测方法。【方法】首先从GenBank数据库中筛选猪特异性的微卫星DNA，根据微卫星DNA核酸序列设计引物，对常见10种动物基因组DNA进行PCR扩增，通过有无扩增产物判断筛选的微卫星DNA对猪源性成分的特异性。然后根据微卫星DNA核酸序列，设计特异性引物和探针，建立猪源性成分Real-time PCR检测方法，采用双标准曲线分别对猪源性成分和总动物源性成分进行定量，计算猪源性成分的百分含量。【结果】筛选到猪特异性微卫星DNA(Accession EF172428)，根据其序列设计的引物SEQ-sus2-F/R只能从猪基因组DNA中扩增出目的条带，其他动物的基因组均无目的条带扩增。建立的Real-time PCR检测方法灵敏度为0.02 ng/25μL反应体系。该方法能够准确检测出混合DNA样品中猪源性成分和混合肉样品中猪源性成分，百分误差分别约为1.32%和1.06%—7.12%。【结论】本研究利用Real-time PCR技术建立的定量猪源性成分的检测方法可以用来检测猪源性成分在混合样品中的百分含量。
[期刊] 水产学报
[作者]
周勇 曾令兵 张辉 范玉顶 徐进
针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1 446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒。经PCR鉴定与测序分析确认正确后,以10倍梯度稀释重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.999 1,斜率为-3.412;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×107copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出鲤疱疹...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
陈千林 刘梦丽 许正茂 王振宝 吉尔格力 史亚明 巴音查汗
为建立牛感染犬新孢子虫的Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测方法，根据犬新孢子虫ＮＣ２基因保守序列设计特异性检测引物和ｔａｑｍａＮ－ｍＧＢ探针，建立新孢子虫病ｔａｑｍａＮ－ｍＧＢ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测方法。ＰＣＲ扩增产物约为１５０ＢＰ，与预期片段大小相符；Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ扩增表明，Ｃｔ值与梯度稀释的阳性质粒模板呈良好的线性关系；当检测牛源性弓形虫、牛环形泰勒和牛巴贝斯等虫种阳性ＤＮａ时均为阴性；经３Ｄ数字ＰＣＲ判定，Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法的最低有效检测量为６．４１拷贝／μｌ，灵敏性是常规ＰＣＲ的１ ０００倍；重复性试验的组内平均变异系数为１．１０８％，组间为２．７３２％；．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
冯华 刘运超 陈玉梅 魏蔷 张改平
为了建立一种基于SYBRGreen的猪圆环病毒2型(PCV2)荧光定量PCR诊断方法,以PCV2 ORF2基因序列为研究对象,构建p MD19T-ORF2重组质粒作为阳性标准品,设计特异性引物,对该方法的最适引物浓度、退火进行了优化,并对该方法的灵敏度、特异性、可重复性以及临床样品检出率进行了评价。结果表明,该方法引物的最佳终浓度为0. 2 mol/L,最适退火温度为55℃;检测限可达到3. 0×10~2个拷贝/mL,而普通PCR检测限在3. 0×10~4个拷贝/mL;溶解曲线分析显示,在77~79℃有单一的溶解峰出现,并与CSFV、PPV、PRRSV、PRV没有交叉反应;组内重复性变异系数为0. 29%~0. 32%,组间变异系数为0. 32%~0. 36%;此外,该方法对临床样品的检出率为81. 5%(31/38),而常规PCR为68. 4%(26/38)。因此,相比常规PCR,该方法更为快速、灵敏、特异、稳定,更适合PCV2临床样品的检测,可为该PCV2早期感染的快速检测提供新方法。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵绪永 马辉 宁豫昌 赵丽
【目的】建立可同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的多重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank数据库中PRV、PPV和PCV2的核苷酸序列,设计3对特异性引物和探针,以10倍系列稀释的阳性质粒为模板,优化反应条件,建立检测PRV、PPV和PCV2的多重Real-time PCR方法,并对其敏感性、重复性和特异性进行检验;分别采用单项和多重Real-time PCR方法,对临床收集的42份疑似病料进行检测,比较2种方法的符合率。【结果】特异性和灵敏度试验表明,建立的多重Real-time PCR检测方法具有高度特异性,与其他病原无明显交叉反...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
白建明 杨琼芬 李先平 隋启君
采用TR IZOL试剂盒和异硫氰酸胍法2种方法提取了带PVX马铃薯试管苗的总RNA。根据设计好的1对特异性引物,运用反转录PCR技术对提取的总RNA进行了体外扩增。结果表明,所用2种方法都能有效地提取马铃薯RNA,并适合于反转录合成病毒cDNA,得到了与预期大小相一致的720 bp片段,而对照未得到任何产物。但利用TR IZOL试剂盒进行RNA提取价格较贵,而异硫氰酸胍法所用试剂可自己配制,方法灵活,价格较TR IZOL试剂盒便宜。从而建立了经济简便的PVX RT-PCR检测体系,为PVX的防治、脱毒种薯和核心种苗的检测提供有效手段。
关键词：
PVX RT-PCR 病毒检测’体系
[期刊] 水产学报
[作者]
殷亮 王庆 曾伟伟 李永刚 王英英 刘春 梁红茹 石存斌 吴淑勤
为了建立和应用可检测基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的荧光定量检测方法,实验根据基因Ⅰ型GCRV的S6保守序列,分别设计扩增目的条带661 bp普通引物(P1、P2)、扩增目的条带159 bp荧光定量引物(F1、F2)和一条探针;同时构建含有目的片段的PVAX1-S6作为标准质粒,10倍梯度稀释构建质粒拷贝数与Ct值的标准曲线(Y=-3.389X+38.076)。结果表明,此方法在3.9×107~3.9×101拷贝/μL之间相关性较好,R2为0.992,最小检测量为4拷贝/μL;且与基因Ⅱ型、Ⅲ型GCRV以及其他病原核酸无交叉反应。运用该方法检测16份草鱼出血病疑似样品,阳性结果为4份;而普...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙炳学 石延霞 朱发娣 谢学文 柴阿丽 李宝聚
【目的】建立一种快速、高效、定量检测黄瓜多主棒孢(Corynespora cassiicola)琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhB)H278R突变的实时荧光定量PCR(AS-real-time PCR)检测方法,并进行效果验证。【方法】从北京市大兴区采集、分离纯化病原菌,获得24株多主棒孢的单孢菌株,采用菌丝生长速率法测定其对啶酰菌胺的EC50,随机选取4株敏感(S)和8株抗性(R)菌株测其菌丝生长速率、产孢量和致病性。采用引物对Cc-SdhB-F/R测定多主棒孢SdhB基因序列,检测SdhB的碱基变化。基于多主棒孢SdhB的相同核酸序列和SNP位点设计内参引物B-H278R-TY-F/R和特异性引物B-H278R-2F/2R14,建立并优化AS-real-time PCR定量检测体系,并对引物的特异性、熔解曲线和灵敏度进行评价。利用该体系分别检测含有H278R不同突变比例的DNA和孢子悬浮液。【结果】测定的24个菌株中,敏感菌株占66.7%,EC50值为0.057—0.563μg·mL~(-1);抗性菌株占33.3%,EC50值为5.395—11.710μg·mL~(-1)。抗性和敏感菌株仅在菌丝生长速率方面存在显著性差异,且菌丝生长速率与EC50之间存在显著负相关。在产孢量和致病性方面不存在显著性差异。测序分析发现抗性菌株均携带SdhB-H278R突变。本研究设计的引物B-H278R-2F和B-H278R-2F2R14特异性强,仅对多主棒孢SdhB-H278R突变菌株的DNA有扩增条带,对其余供试菌株均无条带扩增。普通AS-PCR检测的灵敏度为91 pg·μL~(-1),而AS-real-time PCR的灵敏度可达9.1 pg·μL~(-1),灵敏度为普通AS-PCR的10倍。以基因组DNA为标准品,构建的AS-real-time PCR标准曲线ΔCT值与相对模板浓度的对数有良好的线性关系,相关系数为0.9857,扩增效率为92.59%。熔解曲线吸收峰单一,内参引物B-H278R-TY-F/R和特异性引物B-H278R-2F/2R14分别在87.81℃和91.62℃处出现单一特异性峰。用DNA和孢子悬浮液对标准曲线进行验证,结果表明随着相对模板浓度逐渐降低,该检测体系的准确性逐渐升高且检测下限为5%,同时预期值与试验值呈线性相关(R~2=0.9998和R~2=0.9922)。【结论】建立了一种高效、定量、快速的AS-real-time PCR检测体系用于SdhB-H278R突变位点的检测,可为杀菌剂的抗性治理提供理论依据。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
胥婧 沈秀萍 邵秀玲 胡白石 许志刚
根据风信子黄腐病菌(Xanthom onas hyacinthi,XHA)的fimA基因,合成了1对特异性引物JAAN/JARA,目的片段为226 bp,用来检测样本中有无目标细菌。用XHA全菌体免疫家兔,获得抗血清,建立了检测风信子黄腐病菌的间接免疫荧光染色检测技术。用上述两种方法对风信子黄腐病菌和人工接种发病样品进行检测。结果表明,这两种方法可以准确、灵敏地检测风信子黄腐病菌及带菌样品,方法简单、快速、实用,可以在口岸检疫中推广使用,以减少风信子黄腐病菌进入中国的风险。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王茂华 胡白石 卢玲 刘凤权 许志刚 陈建东
利用通用引物扩增了玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的转录间隔区并进行了序列测定。通过序列比较,设计了一对玉米细菌性枯萎病菌的专化性引物,并对所有参试菌株进行扩增。结果显示:该对引物能从参试的玉米细菌性枯萎病菌中特异性地扩增出1条299bp的条带,而其他参试菌株没有扩增信号。与扩增细菌ITS区域的通用引物结合使用,建立了检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌的巢式PCR技术,其检测灵敏度可达到4个细菌细胞,可以准确、灵敏地检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌。
关键词：
玉米细菌性枯萎病菌 巢式PCR 检测
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
田擎 曾丹丹 李彬 张海峰 王源超 郑小波
［目的］黑白轮枝菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｌｂｏ－ａｔｒｕｍ）能够危害苜蓿等多种作物，是我国重要的检疫性病原真菌。我们基于环介导等温扩增技术（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｌａｍｐ），建立基于颜色判定的简单、快速和灵敏的黑白轮枝菌检测方法。［方法］基于ｌａｍｐ技术，通过比对分析黑白轮枝菌与其相似种不同靶标序列间的差异，选取ｔｕｂ（β－ｔｕｂｌｉｎ，编码β－微管蛋白）基因作为靶标基因，设计并筛选了４条特异性强、灵敏度高的ｌａｍｐ引物和１条环引物，在此基础上建立了检测黑白轮枝菌的ｌａｍｐ体系，并进行特异性、灵敏度试验及田间发病组织的检测。该方法．．．
[期刊] 西南农业学报
[作者]
梁远发
引进国际马铃薯中心（CIP）不同基因型的马铃薯杂交实生籽63个组合8000粒,通过培育、选择、评价,获得抗晚疫病、病毒病、丰产性好等优良性状无性单系26份。其中单系的44—4、61—1O、56—2、50—2、6—2、1—17等已作为杂交亲本利用;50—2、1—17、56—2等已在我省不同生态区域进行适应性鉴定和试种;5—4、38—39已通过省区试,进入生产试验。
关键词：
马铃薯资源 培育 评价 利用
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