为促进长粒型粳稻品种的选育，以粳稻品种东富139、龙粳31和东农427为试验材料，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA和pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA 2个敲除载体，通过农杆菌转化法侵染受体材料的愈伤组织，对GS3和GS9基因进行定点编辑。最终，3个品种在T_2都获得了GS3单基因突变、GS9单基因突变和GS3、GS9双基因突变，且无T-DNA元件的纯合植株。在成熟期对T_2突变体及其野生型的农艺性状进行考察分析，结果表明，与野生型相比，3个品种的gs3突变植株的粒长、千粒质量均显著增加，粒宽、结实率和穗粒数无显著变化；gs9突变体粒长显著增加，粒宽显著减少，千粒质量、结实率和穗粒数无显著变化；gs3gs9突变体粒长增加，且增幅大于gs3和gs9,同时粒宽显著减少，千粒质量显著增加，而结实率和穗粒数无显著变化。综上，利用CRISPR/Cas9技术对东富139、龙粳31和东农427等3个粳稻品种的粒型进行改良，加快了长粒型粳稻新品种的选育进程。

【目的】在植物转基因研究中,使用选择标记基因(Selectable Marker Gene, SMG)使得转化子的筛选更准确便利,但存在SMG的转基因植株可能对人类健康及生态环境造成潜在危害,这也限制了转基因植物商业化的应用前景。因此去除转基因植物中的SMG十分必要。【方法】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对水稻转基因中常用的SMG潮霉素抗性基因(hygromycin phosphotransferase II,hptII)设计构建了编辑载体,利用农杆菌(LBA4404)介导的遗传转化方法转化水稻日本晴,得到转化植株,再将转化植株与带有hptII基因的植株进行杂交。【结果】通过遗传转化及分子鉴定,本研究得到了18株可用于编辑hptII基因的转化植株,进一步对转化植株与带有hptII基因的植株杂交的F_1代进行检测,经PCR检测及测序验证表明,在杂交F_1代植株中,hptII基因的DNA确有编辑发生,包括碱基缺失、替换以及插入等,使得hptII基因不能成功转录。【结论】利用CRISPR/Cas9技术,成功获得了删除hptII基因的转基因水稻。这为植物转基因研究实现无选择标记基因(marker-free)奠定了基础。

细胞因子信号传导抑制蛋白1（SOCS1）是一种重要的负反馈调节因子，广泛参与调控多种细胞因子介导的信号通路，在免疫系统的调节和生物体的生长发育过程中都发挥着至关重要的作用。本实验以已获得的团头鲂socs1a和socs1b基因为编辑对象，在线分析筛选出合适的靶点合成gRNA（guide RNA），然后对1～2细胞期的团头鲂胚胎进行gRNA和Cas9蛋白的混合注射。通过荧光定量PCR在转录水平鉴定socs1a和socs1b的表达和测序在DNA水平鉴定基因的序列突变，成功建立了多种socs1的突变品系。与同期野生型（WT）相比，SOCS1a~(+/-)和SOCS1b~(+/-)团头鲂生长性能增强、体质量显著增加，同时炎症因子TNF-α和IL-6表达量显著增加，而IL-1β表达无明显变化。注射嗜水气单胞菌后，与野生型不同的是，IL-6和TNF-α在SOCS1a~(+/-)和SOCS1b~(+/-)团头鲂的肝脏中的表达均有持续显著上升。本实验通过CRISPR/Cas9系统成功敲除了团头鲂socs1a和socs1b基因，为进一步探讨socs1基因的作用提供了一定的研究基础。同时，也为以养殖鱼类为对象，合理选用CRISPR/Cas9基因编辑技术提供了依据和借鉴。

为了获得经济价值更高的香稻品种,利用成熟的CRISPR/Cas9技术,在水稻Badh2基因上设计sgRNA-E2和sgRNA-E3 2个靶位点,对超级稻品种龙粳31的香味品质进行改良,其中靶位点sgRNA-E2跨第2个内含子和第2个外显子,靶位点sgRNA-E3位于第3外显子区。经检测共获得有碱基突变的转基因植株6株,其中2个单株为纯合突变,4个单株为双等位突变。突变类型包括碱基缺失、插入及碱基变异,其中突变单株Badh2-E2-13有大片段缺失,为双等位突变,分别缺失64,108 bp。在转录水平上发现6个突变株系的Badh2基因表达量均比野生型显著降低(P<0.05)。通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术检测T_0突变体种子的香味物质2AP含量,发现5个突变单株的2AP含量相对野生型显著提高(P

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成为水稻育种新型手段,香稻育种一直是水稻育种行业的研究热点,水稻香味主要由8号染色体上的甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制。为了改良原有品种的香味性状,促进香稻育种的发展,以非香型粳稻品种东农425为试验材料,构建了2个CRISPR/Cas9敲除载体对Badh2基因进行定点编辑,第1个载体(p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA)的2个靶点分别位于第2和第3外显子上,第2个载体(p YLCRISPR/Cas9-B2-gRNA)的2个靶点均在第2外显子上。采用农杆菌介导法对东农425进行遗传转化,成功获得了T0纯合植株,并对其衍生出的T1植株进行T-DNA元件检测,共获得8个突变类型不同且不含有转基因成分的纯合突变株系。同时采用咀嚼法和氢氧化钾浸泡法对这8个纯合突变株系的水稻籽粒进行香味检测,结果表明,8个Badh2株系均具有不同程度的香味,总体上载体p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA编辑的3个株系的香味更为浓郁。对这8个纯合突变株系的主要农艺性状进行考察,发现突变株系的穗数、穗粒数、结实率及千粒质量与野生型相比均没有明显差异。综上,本研究对东农425的Badh2基因成功地进行了编辑,并获得了香味显著提高且无转基因成分的纯合突变体材料,为加快香型粳稻品种的培育提供了技术支持。

【目的】易落粒既不利于稻谷收获,也不适宜于水稻机械化生产。利用现阶段前沿的分子育种手段——CRISPR/Cas9技术对水稻落粒性主效基因qSH1进行定点编辑,并调查分析易落粒性状的改良效果,为创制稳产和适合机械化生产的水稻新种质奠定材料基础和探索新途径。【方法】以qSH1为靶标基因,根据CRISPR/Cas9技术原理设计靶标位点。将所设计的靶点序列在水稻参考基因组中比对分析以排除非特异性靶位点,最终筛选出qSH1-T1和qSH1-T5靶标位点。化学合成靶位点寡核苷酸序列,退火后分别与pYLg RNA-U3、pYLg RNA-U6a载体连接构建U3-qSH1T5-g RNA、U6a-qSH1T1-g RNA表达盒,最后将2个g RNA表达盒同时连接至pYLCRISPR/Cas9表达载体中,构建pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51表达载体。利用农杆菌介导转化易落粒的籼稻品种HR1128,以潮霉素抗性为筛选标记筛选获得T0代转基因阳性植株。利用靶位点扩增测序法判断T0代转基因植株在预期靶标位点是否发生突变,并进一步分析突变类型及基因型。将靶点序列在水稻参考基因组中比对,选择与靶点序列匹配度大于或等于15 bp且3′端具有NGG的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估。利用潮霉素基因及靶点检测进一步筛选无T-DNA成分的qsh1突变植株并进一步构建qsh1突变系,并分析qsh1突变系的落粒性、qSH1的表达量及预测编码氨基酸序列。【结果】pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51载体成功地实现了对qSH1靶标位点的定点编辑。在T0代转基因阳性植株中获得7个突变单株,其中qSH1-T1和qSH1-T5靶点的突变频率分别为54.55%和63.64%,突变基因型包括纯合突变、杂合突变、双等位突变和嵌合突变,突变类型包括碱基插入、碱基缺失及碱基突变。通过对T1代植株进行潮霉素基因筛选、靶位点扩增测序,结果表明,在T1代植株中Cas9载体骨架和qSH1突变位点都发生了分离,获得2种不含T-DNA成分的qsh1纯合突变株,并以此构建2个T2代qsh1纯合突变系群体(17SZ01和17SZ02)。对46株转基因阳性植株进行脱靶效应分析,发现3个潜在脱靶位点均未发生突变,表明所设计的靶标位点具有较高的特异性。通过落粒性测定分析表明,与野生型对照相比,2个qsh1纯合突变系的落粒性显著降低。进一步分析发现,2个突变系氨基酸翻译均发生改变并提前终止,同时17SZ01突变系qSH1的表达量显著降低。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对水稻基因组进行定点编辑定向改良水稻品种落粒性,是一条高效、安全的分子改良育种策略。

比较三种常用的CRISPR/Cas9基因敲除检测变异方法,从准确性、耗时、成本和应用限制等方面进行评估。采用T7核酸内切酶I、限制性内切酶和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分别对利用CRISPR/Cas9方法敲除的fibinb和ngs基因的50尾斑马鱼(Danio rerio)突变纯合个体和突变杂合个体进行检测,用野生型个体作对照;同时用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对CRISPR/Cas9方法敲除的ogn和ddb1基因的突变杂合个体进行了检测。结果表明:三种方法均能够区分突变杂合个体,其中T7核酸内切酶I检测法耗时最短,但该方法不能用于鉴定突变纯合个体;限制性内切酶检测法能够用于鉴定纯合个体,但需要有特异性的识别位点;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法能够区分纯合和杂合个体,对序列无依赖性,能够检测出序列中存在的所有变异。成本上,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法最经济;限制性内切酶的价格存在较大的差异,因此检测成本依赖于酶的价格。三种检测方法各有优缺点,在应用实践中可根据试验需要选择合适的方法。

细胞周期蛋白M2(CNNM2)是参与体内镁离子平衡的重要候选基因,实验采用的CRISPR/Cas9系统是近几年发展起来的一类新型基因打靶技术。在斑马鱼CNNM2基因的一号外显子处选取打靶位点,构建sgRNA表达载体。随后将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA混合物分别以约30 pg和300 pg的剂量显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中实现对目的靶基因CNNM2的敲除。24~48 h后PCR产物回收,限制性酶切法初步检测基因打靶情况,最后进行测序分析确定突变类型。为进一步验证突变的稳定遗传性,选择了具有敲除效率的F0与野生型斑马鱼进行外交,对获得的F1进行逐一剪尾,提取DNA进行PCR和测序...

细胞周期蛋白Ｍ２（ＣＮＮＭ２）是参与体内镁离子平衡的重要候选基因，实验采用的ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ９系统是近几年发展起来的一类新型基因打靶技术。在斑马鱼ＣＮＮＭ２基因的一号外显子处选取打靶位点，构建ＳｇＲＮａ表达载体。随后将体外转录的ＳｇＲＮａ和ＣａＳ９ ＭＲＮａ混合物分别以约３０ Ｐｇ和３００ Ｐｇ的剂量显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中实现对目的靶基因ＣＮＮＭ２的敲除。２４～４８ ｈ后ＰＣＲ产物回收，限制性酶切法初步检测基因打靶情况，最后进行测序分析确定突变类型。为进一步验证突变的稳定遗传性，选择了具有敲除效率的Ｆ０与野生型斑马鱼进行外交，对获得的Ｆ１进行逐一剪尾，提取ＤＮａ进行ＰＣＲ和测序．．．

以甘蓝型油菜‘湘油15号’为试材,通过生物信息学分析,运用CRISPR/Cas9系统对Bna SDG8第1个外显子上的Bna SDG8–A和Bna SDG8–C保守序列区域进行CRISPR/Cas9敲除位点设计,构建了CRISPR/Cas9敲除载体p CAMBIA1300–sg RNA/Cas9–Bna SDG8;通过遗传转化,获得转化植株19株;经测序比对,4株植株的Bna SDG8被成功编辑;通过对定向敲除植株开花时间的统计分析,初步确定Bna SDG8参与甘蓝型油菜开花时间的调控。

[目的] 本文旨在利用基因编辑技术，降低水稻直链淀粉含量，改善稻米食味品质特性，以培育直链淀粉含量降低的优质育种材料。[方法] 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，下调水稻品种‘宁粳4号’淀粉合酶基因（SSSIIb）的表达，对转基因家系进行目标基因的分子鉴定和主要农艺性状、生理生化指标的测定，选出目标育种材料。[结果] 对淀粉合酶基因SSSIIb进行多靶位点编辑，得到3个目标基因敲除的转基因家系，分别为SSS2-Q、SSS2-Z和SSS2-H家系。与‘宁粳4号’相比，SSS2-Q家系直链淀粉含量显著下降，支链淀粉链长分布呈现中等链长减少，而胶稠度和热浆黏度、冷浆黏度等指标均优于‘宁粳4号’，品质指标达到预期目标，但每穗实粒数和结实率降低，粒长增加。而在SSS2-Z与SSS2-H家系中，品质指标没有实现预期目标。RT-qPCR分析发现，SSS2-Q家系中SSSIIb基因表达下调，其他淀粉合成相关基因表达出现变化。[结论] 通过CRISPR/Cas9技术，靶向编辑了‘宁粳4号’中SSSIIb基因，降低了SSS2-Q家系直链淀粉含量，品质指标得到改善，为优质食味转基因水稻新品种培育提供新种质。

【目的】通过CRISPR/Cas9技术同时编辑多个粒型基因，获得粒长增加、粒宽降低的理想粒型，快速提高三系杂交稻恢复系的外观品质，为三系杂交稻提供优良亲本材料。【方法】利用CRISPR/Cas9技术在恢复系桂恢582（GH582）中同时敲除粒型基因GS3、GW8和TGW3，在T_(2)代选择突变位点纯合无标记基因且符合预期目标的单株鉴定为新恢复系，并对新恢复系进行主要农艺性状及透明度、垩白度、垩白粒率等米质相关性状分析。【结果】对恢复系GH582多个不同粒型突变单株的3个突变基因位点进行测序分析，获得4种突变类型：GW8tgw3GS3，GW8TGW3gs3，gw8TGW3gs3和gw8tgw3gs3。结合粒型分析显示gs3及tgw3基因的单独突变都显著增加了籽粒长（P<0.05，下同）；籽粒宽的显著下降主要来自gw8突变；三者同时突变（gw8tgw3gs3）使得籽粒长增加的叠加效应明显。选择三基因位点突变体（gw8tgw3gs3）鉴定为新恢复系GH582E。农艺性状分析显示，GH582E相较GH582，籽粒长由8.62 mm增加至10.21 mm，增加了18.4%；籽粒宽度由2.82 mm下降至2.45 mm，下降了13.1%，其他农艺性状无显著变化（P>0.05）。米质分析显示，由于GH582E米粒长增加，米粒宽降低，使得透明度升高，垩白粒率和垩白度极显著下降（P<0.01），外观品质得到提升。【结论】通过CRISPR/Cas9技术改良粒型可快速提升水稻恢复系的外观品质，促进现有资源的有效利用，提高杂交稻亲本的育种效率。

【目的】通过CRISPR/Cas9技术同时编辑多个粒型基因，获得粒长增加、粒宽降低的理想粒型，快速提高三系杂交稻恢复系的外观品质，为三系杂交稻提供优良亲本材料。【方法】利用CRISPR/Cas9技术在恢复系桂恢582(GH582)中同时敲除粒型基因GS3、GW8和TGW3,在T_2代选择突变位点纯合无标记基因且符合预期目标的单株鉴定为新恢复系，并对新恢复系进行主要农艺性状及透明度、垩白度、垩白粒率等米质相关性状分析。【结果】对恢复系GH582多个不同粒型突变单株的3个突变基因位点进行测序分析，获得4种突变类型：GW8tgw3GS3、GW8TGW3gs3、gw8TGW3gs3和gw8tgw3gs3。结合粒型分析显示gs3和tgw3基因的单独突变均显著增加了籽粒长(P<0.05,下同);籽粒宽的显著下降主要来自gw8基因突变；三者同时突变(gw8tgw3gs3)使得籽粒长增加的叠加效应明显。选择3基因位点突变体(gw8tgw3gs3)鉴定为新恢复系GH582E。农艺性状分析结果显示，GH582E相较GH582,籽粒长由8.62 mm增加至10.21 mm,增加18.4%;籽粒宽度由2.82 mm下降至2.45 mm,下降13.1%,其他农艺性状无显著变化(P>0.05)。米质分析结果显示，由于GH582E米粒长增加，米粒宽降低，使得透明度升高，垩白粒率和垩白度极显著下降(P<0.01),外观品质得到提升。【结论】通过CRISPR/Cas9技术改良粒型可快速提升水稻恢复系的外观品质，促进现有资源的有效利用，提高杂交稻亲本的育种效率。

【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T_0代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式,均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株,在第2外显子处共有5株,均为单碱基插入;在第7外显子处有6株,均为片段缺失。48株T_1代秀水134基因编辑株系中,共获得16株无转基因标记的基因编辑株系,其中5株在第2外显子发生突变,11株在第7外显子处发生突变。4个T_2代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295μg·g~(-1),极显著(P<0.01)高于非转基因对照(0.046μg·g~(-1))。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑,并且可获得无转基因成分的基因编辑株系,其香味性状得到明显改良。

【目的】克隆山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因（CASase）DNA全长序列，构建CRISPR/Cas9敲除载体，为筛选“低毒、高硫”山黧豆品系奠定基础。【方法】以萌发4 d山黧豆幼苗根部为材料，提取其基因组DNA，利用PCR克隆CASase基因全长；经序列同源性、内含子、外显子、sgRNA靶位点和脱靶分析后，在CASase cDNA上选取5个sgRNA靶位点进行寡核苷酸链设计和体外活性检测；从5个sgRNA靶位点中取活性较高的4个sgRNA，利用酶切连接法构建基因敲除载体pPLHACas9-sgRNA20r