【目的】通过CRISPR/Cas9技术同时编辑多个粒型基因，获得粒长增加、粒宽降低的理想粒型，快速提高三系杂交稻恢复系的外观品质，为三系杂交稻提供优良亲本材料。【方法】利用CRISPR/Cas9技术在恢复系桂恢582（GH582）中同时敲除粒型基因GS3、GW8和TGW3，在T_(2)代选择突变位点纯合无标记基因且符合预期目标的单株鉴定为新恢复系，并对新恢复系进行主要农艺性状及透明度、垩白度、垩白粒率等米质相关性状分析。【结果】对恢复系GH582多个不同粒型突变单株的3个突变基因位点进行测序分析，获得4种突变类型：GW8tgw3GS3，GW8TGW3gs3，gw8TGW3gs3和gw8tgw3gs3。结合粒型分析显示gs3及tgw3基因的单独突变都显著增加了籽粒长（P<0.05，下同）；籽粒宽的显著下降主要来自gw8突变；三者同时突变（gw8tgw3gs3）使得籽粒长增加的叠加效应明显。选择三基因位点突变体（gw8tgw3gs3）鉴定为新恢复系GH582E。农艺性状分析显示，GH582E相较GH582，籽粒长由8.62 mm增加至10.21 mm，增加了18.4%；籽粒宽度由2.82 mm下降至2.45 mm，下降了13.1%，其他农艺性状无显著变化（P>0.05）。米质分析显示，由于GH582E米粒长增加，米粒宽降低，使得透明度升高，垩白粒率和垩白度极显著下降（P<0.01），外观品质得到提升。【结论】通过CRISPR/Cas9技术改良粒型可快速提升水稻恢复系的外观品质，促进现有资源的有效利用，提高杂交稻亲本的育种效率。

【目的】通过CRISPR/Cas9技术同时编辑多个粒型基因，获得粒长增加、粒宽降低的理想粒型，快速提高三系杂交稻恢复系的外观品质，为三系杂交稻提供优良亲本材料。【方法】利用CRISPR/Cas9技术在恢复系桂恢582(GH582)中同时敲除粒型基因GS3、GW8和TGW3,在T_2代选择突变位点纯合无标记基因且符合预期目标的单株鉴定为新恢复系，并对新恢复系进行主要农艺性状及透明度、垩白度、垩白粒率等米质相关性状分析。【结果】对恢复系GH582多个不同粒型突变单株的3个突变基因位点进行测序分析，获得4种突变类型：GW8tgw3GS3、GW8TGW3gs3、gw8TGW3gs3和gw8tgw3gs3。结合粒型分析显示gs3和tgw3基因的单独突变均显著增加了籽粒长(P<0.05,下同);籽粒宽的显著下降主要来自gw8基因突变；三者同时突变(gw8tgw3gs3)使得籽粒长增加的叠加效应明显。选择3基因位点突变体(gw8tgw3gs3)鉴定为新恢复系GH582E。农艺性状分析结果显示，GH582E相较GH582,籽粒长由8.62 mm增加至10.21 mm,增加18.4%;籽粒宽度由2.82 mm下降至2.45 mm,下降13.1%,其他农艺性状无显著变化(P>0.05)。米质分析结果显示，由于GH582E米粒长增加，米粒宽降低，使得透明度升高，垩白粒率和垩白度极显著下降(P<0.01),外观品质得到提升。【结论】通过CRISPR/Cas9技术改良粒型可快速提升水稻恢复系的外观品质，促进现有资源的有效利用，提高杂交稻亲本的育种效率。

为了获得经济价值更高的香稻品种,利用成熟的CRISPR/Cas9技术,在水稻Badh2基因上设计sgRNA-E2和sgRNA-E3 2个靶位点,对超级稻品种龙粳31的香味品质进行改良,其中靶位点sgRNA-E2跨第2个内含子和第2个外显子,靶位点sgRNA-E3位于第3外显子区。经检测共获得有碱基突变的转基因植株6株,其中2个单株为纯合突变,4个单株为双等位突变。突变类型包括碱基缺失、插入及碱基变异,其中突变单株Badh2-E2-13有大片段缺失,为双等位突变,分别缺失64,108 bp。在转录水平上发现6个突变株系的Badh2基因表达量均比野生型显著降低(P<0.05)。通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术检测T_0突变体种子的香味物质2AP含量,发现5个突变单株的2AP含量相对野生型显著提高(P

[目的] 本文旨在利用基因编辑技术，降低水稻直链淀粉含量，改善稻米食味品质特性，以培育直链淀粉含量降低的优质育种材料。[方法] 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，下调水稻品种‘宁粳4号’淀粉合酶基因（SSSIIb）的表达，对转基因家系进行目标基因的分子鉴定和主要农艺性状、生理生化指标的测定，选出目标育种材料。[结果] 对淀粉合酶基因SSSIIb进行多靶位点编辑，得到3个目标基因敲除的转基因家系，分别为SSS2-Q、SSS2-Z和SSS2-H家系。与‘宁粳4号’相比，SSS2-Q家系直链淀粉含量显著下降，支链淀粉链长分布呈现中等链长减少，而胶稠度和热浆黏度、冷浆黏度等指标均优于‘宁粳4号’，品质指标达到预期目标，但每穗实粒数和结实率降低，粒长增加。而在SSS2-Z与SSS2-H家系中，品质指标没有实现预期目标。RT-qPCR分析发现，SSS2-Q家系中SSSIIb基因表达下调，其他淀粉合成相关基因表达出现变化。[结论] 通过CRISPR/Cas9技术，靶向编辑了‘宁粳4号’中SSSIIb基因，降低了SSS2-Q家系直链淀粉含量，品质指标得到改善，为优质食味转基因水稻新品种培育提供新种质。

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成为水稻育种新型手段,香稻育种一直是水稻育种行业的研究热点,水稻香味主要由8号染色体上的甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制。为了改良原有品种的香味性状,促进香稻育种的发展,以非香型粳稻品种东农425为试验材料,构建了2个CRISPR/Cas9敲除载体对Badh2基因进行定点编辑,第1个载体(p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA)的2个靶点分别位于第2和第3外显子上,第2个载体(p YLCRISPR/Cas9-B2-gRNA)的2个靶点均在第2外显子上。采用农杆菌介导法对东农425进行遗传转化,成功获得了T0纯合植株,并对其衍生出的T1植株进行T-DNA元件检测,共获得8个突变类型不同且不含有转基因成分的纯合突变株系。同时采用咀嚼法和氢氧化钾浸泡法对这8个纯合突变株系的水稻籽粒进行香味检测,结果表明,8个Badh2株系均具有不同程度的香味,总体上载体p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA编辑的3个株系的香味更为浓郁。对这8个纯合突变株系的主要农艺性状进行考察,发现突变株系的穗数、穗粒数、结实率及千粒质量与野生型相比均没有明显差异。综上,本研究对东农425的Badh2基因成功地进行了编辑,并获得了香味显著提高且无转基因成分的纯合突变体材料,为加快香型粳稻品种的培育提供了技术支持。

为促进长粒型粳稻品种的选育，以粳稻品种东富139、龙粳31和东农427为试验材料，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA和pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA 2个敲除载体，通过农杆菌转化法侵染受体材料的愈伤组织，对GS3和GS9基因进行定点编辑。最终，3个品种在T_2都获得了GS3单基因突变、GS9单基因突变和GS3、GS9双基因突变，且无T-DNA元件的纯合植株。在成熟期对T_2突变体及其野生型的农艺性状进行考察分析，结果表明，与野生型相比，3个品种的gs3突变植株的粒长、千粒质量均显著增加，粒宽、结实率和穗粒数无显著变化；gs9突变体粒长显著增加，粒宽显著减少，千粒质量、结实率和穗粒数无显著变化；gs3gs9突变体粒长增加，且增幅大于gs3和gs9,同时粒宽显著减少，千粒质量显著增加，而结实率和穗粒数无显著变化。综上，利用CRISPR/Cas9技术对东富139、龙粳31和东农427等3个粳稻品种的粒型进行改良，加快了长粒型粳稻新品种的选育进程。

利用携有白叶枯病抗性基因 Xa-5,Xa-7的抗源 DV_(85)衍生而来、但经济性状明显改善的 TD-1、TD-2为抗病供体亲本,与对白叶枯病感染的杂交稻优良恢复系明恢63杂交,在对目标性状——抗白叶枯病持性的强烈选择压下,与轮回亲本回交2次。然后自交,以便于其它有利基因重组,通过按产量与抗性进行鉴定与选择,目前所选育的抗18、抗21、抗25用白叶枯病强菌株浙173接种为高抗(HR),且抗病性状在与感病不育系配组的杂种 F_1中呈完全显性表达。这此抗系与珍汕97A 杂交的 F_1杂种农艺性状都近似于汕优63——珍汕97A/明恢63,在江、皖、豫、鄂等白叶枯病病区的杂交稻生产上有应用前景。再继...

【目的】培育适合广西种植的抗螟虫转基因杂交水稻恢复系，为广西杂交水稻抗虫育种提供基础材料。【方法】以广西杂交稻骨干恢复系亲本广恢998、桂恢1561和桂恢110为受体，以携带Bt抗虫基因cry1C~*的抗螟虫转基因材料T1C-19为供体，通过1次杂交、3次回交和8次自交，利用分子标记辅助选择(MAS)技术，结合抗虫鉴定(室内离体接虫鉴定与室外自然鉴定)、苏云金芽孢杆菌(Baclillus thuringiensis)蛋白(Bt蛋白)含量测定和农艺性状选择培育适合广西推广应用的抗螟虫杂交水稻恢复系。【结果】对经过杂交、回交和自交育成的3个抗螟虫转基因恢复系KH998、KH1561和KH110进行农艺性状考查，结果表明，KH998、KH1561和KH110的千粒重均低于供体亲本T1C-19,KH1561的千粒重比原始亲本桂恢1561低，而KH998和KH110的千粒重较原始亲本分别提高1.40和3.40 g,产量优势变大；以KH110组配的杂交组合天丰A/KH110的产量比对照天优华占(CK2)增加1.29%,但所组配的其他杂交组合产量均低于对照特优63(CK1)和CK2。抗虫鉴定结果表明，KH998、KH1561和KH110及其配配杂交组合均具有与抗虫供体亲本T1C-19相当的抗性，均可有效抵御螟虫危害；杀虫蛋白含量测定结果表明，KH998、KH1561和KH110的平均Bt蛋白含量分别为0.24、0.65和1.41μg/g FW,其中，KH998和KH1561抗性群体的Bt蛋白能稳定表达，而KH110抗性群体的Bt蛋白表达不够稳定。【结论】通过回交转育结合MAS育成的3个抗螟虫转基因恢复系KH998、KH1561和KH110均可稳定遗传cry1C~*基因，并成功表达Bt杀虫蛋白，且具有与供体亲本T1C-19相当的抗螟虫能力。

【目的】通过分子标记辅助选择培育长粒型新恢复系,为杂交水稻长粒型育种提供新的种质资源。【方法】利用常规回交育种、分子标记辅助选择和抗病鉴定,结合粒型和低垩白等形态性状选择,将长粒型基因gs3导入短粒型优良恢复系中间材料R33947中。【结果】培育出了4个新的长粒、低垩白和产量较高的改良系。他们的基因位点没有差异,但粒形和产量性状有明显不同。其中,RGL3株系配合力较好,后定名为成恢637。利用该恢复系与优质香稻不育系川康606A配制的杂交水稻新组合"川康优637"在长江上游区域试验中比对照F优498增产4.7%,米质优良。【结论】通过常规的回交选育、分子标记辅助选择和抗病鉴定,结合优良形态选择的方法,筛选获得4份gs3纯合的优质抗病改良系,为选育新的优质水稻恢复系提供种质资源。育成优良恢复系成恢637,其与优质香稻不育系川康606A配制的新组合"川康优637"具有品质优良、丰产性好、抗病性强等特点。

【目的】OsIAA11参与的生长素信号途径在水稻生长发育阶段和环境因子响应中起重要作用,并影响水稻生育后期的产量形成过程。利用CRISPR/Cas9编辑技术对粳稻中花11(ZH11)的OsIAA11序列进行编辑,获得OsIAA11突变植株,通过对突变植株的农艺性状指标开展田间调查分析,以期探索OsIAA11突变对水稻产量构成因子的影响。【方法】依据CRISPR/Cas9编辑原理,在OsIAA11第1和第2外显子区域设计2个20 bp的编辑靶点,并在水稻基因组数据库中比对分析靶点序列,排除非特异性编辑,将2个靶点核苷酸片段分别与pYLgRNA-U6a和pYLgRNA-U6b载体连接,通过2次PCR扩增,得到含特异性连接接头的U6a-IAA11-T1和U6b-IAA11-T2表达盒,再将2个表达盒连接到pYLCRISPR/Cas9-MT载体上,获得pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12重组表达载体,利用农杆菌介导法转化ZH11愈伤组织,再生培养得到T0代转基因幼苗,通过PCR扩增潮霉素抗性基因获得阳性株系。对T2代植株的靶点区域序列进行PCR扩增和测序分析,鉴定OsIAA11突变类型,并考察突变植株的田间农艺性状。【结果】pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12表达载体成功转化ZH11水稻愈伤组织,并获得25株转基因再生植株,经潮霉素鉴定得到20株阳性株系,从阳性植株的T2后代中鉴定出17种在2个靶点区域都发生编辑的纯合突变类型植株,除osiaa11-20-1、osiaa11-21-2、osiaa11-23和osiaa11-25在第1个靶点、以及osiaa11-22-2在第2个靶点是单碱基插入突变外,其他突变植株在第1个靶点为小片段缺失突变,在第2个靶点多为单碱基缺失突变。对17种不同基因型osiaa11突变体的农艺性状调查表明,与野生型水稻相比,突变体水稻的株高、有效穗数、穗长、穗粒数、结实率、千粒重、收获指数以及谷草比等性状未发生明显变化,而分蘖成穗率则显著降低,表明无效分蘖增多。【结论】采用CRISPR/Cas9技术对OsIAA11序列进行编辑,得到17种不同基因型的osiaa11突变体水稻,其分蘖成穗率显著降低,无效分蘖变多,表明OsIAA11参与了生长素对分蘖芽发生的调节代谢。

综合制药工程专业实践教学要求和学科前沿方向,设计了"基于酵母杂交的CRISPR/Cas9基因编辑"实验。该实验先采用基因重组技术,分别构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,以及重组酵母yPH1和y PH6-8,再利用酵母杂交平台研究CRISPR/Cas9基因编辑载体的靶向性和脱靶机率。该实验内容包括微生物培养、微生物生长曲线绘制、基因重组技术、基因表达和CRISPR/Cas9基因编辑技术,以及学习Origin作图软件和荧光成像技术。该实验具有综合性、设计性和研究性特点,同时具有材料成本低、过程简化和结果明显的优势,不仅方便学生学习基因编辑原理,掌握基因编辑核心技术,了解脱靶效应的普通性,而且有利于培养学生的创造性思维,提高分析、解决问题的能力。

从控制携带恢复基因的花粉源入手，模拟繁殖中杂交稻对不育系生物学混杂后的回交和自交过程，探讨了恢复基因的迁移和传递与不育系自交结实的关系。结果表明，杂交稻的恢复基因迁移至不育系以后，经过一代到二代的回交与自交，其后代的外观性状迅速向回交亲本靠近，出现外形趋同于不育系、结实率有高有低的“同质同形恢”，从而产生不育系自交结实现象。回复突变以及环境的影响，不是导致不育系自交结实的重要原因。

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行有效定点编辑,为作物的遗传育种提供了新的方向。以感病水稻品种丽江为材料,抗病基因OsCOL9为靶基因,探索该系统对水稻内源基因定点编辑效率以及获得有研究意义的突变体。OsCOL9基因CDS序列全长1 266 bp,编码一个422 aa蛋白,分子量大小约为45.6 k Da,蛋白质结构的N端含有B-box结构域,C端含有CCT(CONSTANS、CONSTANS-Like、TOC1)结构域。设计4个长20 nt的guide RNAs(gRNAs)靶点,靶向编辑

为了定向改良籼稻恢复系R389及其配制的杂交种的稻瘟病抗性,利用广谱持久抗稻瘟病基因Pi9设计特异性功能分子标记Ins1-1,用于开展分子标记辅助选择连续回交育种。室内接种抗菌圃分析结果表明,Pi9基因供体亲本75-1-127对20份供试稻瘟病菌中的18个小种表现出高水平抗性,而受体亲本R389对其中11个小种表现出抗性,双亲间抗性表现与抗菌谱差异明显,抗性频率分别为90.0%,55.0%;供体亲本75-1-127在自然稻瘟病病圃的苗瘟和穗瘟抗性表现均为高抗,R389的苗瘟和穗瘟抗性表现均为高感。Ins1-1是一个基于PCR的显性DNA标记,在两亲本间表现出明显且稳定的多态性;在Pi9供体亲本75-1-127和改良获得的R389群体及其配制的杂交种基因组中均扩增出一条大小为513 bp的稳定条带,而在受体亲本R389及两优389基因组中均无扩增产物;Ins1-1标记基因型对稻瘟病抗性表型的辅助选择效率达100%。从26个含Pi9纯合等位基因的BC6F3株系中筛选出一个高抗苗瘟和穗瘟、田间性状与受体亲本R389接近的改良恢复系R389-Pi9,并用它与温敏不育系P88s配制出高抗稻瘟病的两系杂交种两优389-Pi9;田间小区栽培试验结果表明,改良恢复系及其所配置的杂交种的全生育期、株高、结实率、千粒质量等主要农艺性状与相应对照相比均无显著差异,表现为遗传背景基本一致,实现了定向改良恢复系R389及其杂交种稻瘟病抗性的目标。

讨论了利用光、温敏核不育两用系的杂交稻育种途径。指出核不育两用系除育性不容易稳定外，其配合力选择受育性选择的制约，造成育种工作的低效率。核不育两用系失去了核质互作型不育系具备的自主防护和被动防护的双重功能。初步应用的低温敏不育系，人工选择和自然选择对温度临界点的压力、方向正好相反，更容易发生混杂退化。核不育两用系繁殖和制种在地域和季节上受到很大限制，而亲本种子却难以控制，可能给杂交稻种子生产带来不良后果。因此，两系法不可能取代三系法而成为杂交稻育种的主要方向。