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[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
黄振玉 竹个个 邹华锋 吕为群
细胞周期蛋白M2(CNNM2)是参与体内镁离子平衡的重要候选基因,实验采用的CRISPR/Cas9系统是近几年发展起来的一类新型基因打靶技术。在斑马鱼CNNM2基因的一号外显子处选取打靶位点,构建sgRNA表达载体。随后将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA混合物分别以约30 pg和300 pg的剂量显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中实现对目的靶基因CNNM2的敲除。24~48 h后PCR产物回收,限制性酶切法初步检测基因打靶情况,最后进行测序分析确定突变类型。为进一步验证突变的稳定遗传性,选择了具有敲除效率的F0与野生型斑马鱼进行外交,对获得的F1进行逐一剪尾,提取DNA进行PCR和测序...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
黄振玉 竹个个 邹华锋 吕为群
细胞周期蛋白Ｍ２（ＣＮＮＭ２）是参与体内镁离子平衡的重要候选基因，实验采用的ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ９系统是近几年发展起来的一类新型基因打靶技术。在斑马鱼ＣＮＮＭ２基因的一号外显子处选取打靶位点，构建ＳｇＲＮａ表达载体。随后将体外转录的ＳｇＲＮａ和ＣａＳ９ ＭＲＮａ混合物分别以约３０ Ｐｇ和３００ Ｐｇ的剂量显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中实现对目的靶基因ＣＮＮＭ２的敲除。２４～４８ ｈ后ＰＣＲ产物回收，限制性酶切法初步检测基因打靶情况，最后进行测序分析确定突变类型。为进一步验证突变的稳定遗传性，选择了具有敲除效率的Ｆ０与野生型斑马鱼进行外交，对获得的Ｆ１进行逐一剪尾，提取ＤＮａ进行ＰＣＲ和测序．．．
[期刊] 西南农业学报
[作者]
彭梅芳 甘凤 潘春梅 宋健兰 范晓丽 陈克贵
【目的】在植物转基因研究中,使用选择标记基因(Selectable Marker Gene, SMG)使得转化子的筛选更准确便利,但存在SMG的转基因植株可能对人类健康及生态环境造成潜在危害,这也限制了转基因植物商业化的应用前景。因此去除转基因植物中的SMG十分必要。【方法】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对水稻转基因中常用的SMG潮霉素抗性基因(hygromycin phosphotransferase II,hptII)设计构建了编辑载体,利用农杆菌(LBA4404)介导的遗传转化方法转化水稻日本晴,得到转化植株,再将转化植株与带有hptII基因的植株进行杂交。【结果】通过遗传转化及分子鉴定,本研究得到了18株可用于编辑hptII基因的转化植株,进一步对转化植株与带有hptII基因的植株杂交的F_1代进行检测,经PCR检测及测序验证表明,在杂交F_1代植株中,hptII基因的DNA确有编辑发生,包括碱基缺失、替换以及插入等,使得hptII基因不能成功转录。【结论】利用CRISPR/Cas9技术,成功获得了删除hptII基因的转基因水稻。这为植物转基因研究实现无选择标记基因(marker-free)奠定了基础。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
卢培钰 冯毅栋 鲍宝龙
本研究探究了aldh3a2a在斑马鱼色素细胞发育中的意义及其对醛代谢和肝脏健康的影响。利用CRISPR/Cas9技术，成功构建aldh3a2a敲除纯合突变家系，导致黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞数量减少，csf1ra、pnp4a、itk下调，黑色素合成通路关键基因mitfa、tyrp1b和kita下调。转录组分析揭示了基因表达谱系的变化，差异基因scd、lpla和aox5在类固醇生物合成途径中下调，指示aldh3a2a对类固醇生物合成的关键作用。对视黄醇代谢通路的转录组分析和qpcr联合研究结果表明，aldh3a2a可以调控raldh2、rxrab以及aox5，表明其对视黄酸受体的信号传导有一定影响，同时aldh3a2a可以调控钾离子通道蛋白kcns3b，指示其对色素细胞的影响与钾离子信号传导有关。GO和KEGG富集分析发现突变体的细胞周期、同源重组、RNA降解、RNA转运、p53信号通路、真核生物核糖体生物发生、DNA复制、碱基切除修复、氨基酰基-tRNA生物合成、细胞质DNA传感通路、类固醇生物合成、错配修复、类固醇激素生物合成和醛酸盐代谢等通路也有着广泛影响。此外，aldh3a2a基因敲除会导致体内醛积累明显，产生细胞毒性进而引发肝脏体积异常增大、肝脏内出现空泡，体质量增加的表征，类似于Sj?gren-Larsson综合征的症状，揭示了aldh3a2a在斑马鱼体内的作用及其与人类遗传疾病的相关性，将有助于更深入地了解其在斑马鱼和人类中的功能和潜在的治疗靶点。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
朱哲 胡沛男 李伟明 祖尧
转录因子TBX20在脊椎动物心脏的腔室发育和维护中起至关重要的作用。利用CRISPR/Cas9系统成功制备了斑马鱼tbx20突变鱼系,T7E1检测结果显示F_0敲除效率平均为42. 1%,测序分析F_1中突变种质遗传效率为36. 7%。F_2突变体中观察到心脏突变表型:48 hpf,心包腔肿大,静脉窦瘀血,环化异常,心脏结构变形; 3 dpf,心脏畸形拉伸成线状结构。原位杂交和qRT-PCR结果显示,突变体中vmhc表达上调,amhc和myl7表达下调。成功制备了斑马鱼tbx20突变体,结果表明tbx20纯合突变体心脏畸形,环化受到影响,为深入探究tbx20在早期心脏腔室分化过程中的作用奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
韩政宏 段宇轩 徐善斌 王敬国 刘化龙 杨洛淼 贾琰 辛威 郑洪亮 邹德堂
为促进长粒型粳稻品种的选育，以粳稻品种东富139、龙粳31和东农427为试验材料，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA和pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA 2个敲除载体，通过农杆菌转化法侵染受体材料的愈伤组织，对GS3和GS9基因进行定点编辑。最终，3个品种在T_2都获得了GS3单基因突变、GS9单基因突变和GS3、GS9双基因突变，且无T-DNA元件的纯合植株。在成熟期对T_2突变体及其野生型的农艺性状进行考察分析，结果表明，与野生型相比，3个品种的gs3突变植株的粒长、千粒质量均显著增加，粒宽、结实率和穗粒数无显著变化；gs9突变体粒长显著增加，粒宽显著减少，千粒质量、结实率和穗粒数无显著变化；gs3gs9突变体粒长增加，且增幅大于gs3和gs9,同时粒宽显著减少，千粒质量显著增加，而结实率和穗粒数无显著变化。综上，利用CRISPR/Cas9技术对东富139、龙粳31和东农427等3个粳稻品种的粒型进行改良，加快了长粒型粳稻新品种的选育进程。
[期刊] 水产学报
[作者]
赵心愉 刘娟 邹曙明
细胞因子信号传导抑制蛋白1（SOCS1）是一种重要的负反馈调节因子，广泛参与调控多种细胞因子介导的信号通路，在免疫系统的调节和生物体的生长发育过程中都发挥着至关重要的作用。本实验以已获得的团头鲂socs1a和socs1b基因为编辑对象，在线分析筛选出合适的靶点合成gRNA（guide RNA），然后对1～2细胞期的团头鲂胚胎进行gRNA和Cas9蛋白的混合注射。通过荧光定量PCR在转录水平鉴定socs1a和socs1b的表达和测序在DNA水平鉴定基因的序列突变，成功建立了多种socs1的突变品系。与同期野生型（WT）相比，SOCS1a~(+/-)和SOCS1b~(+/-)团头鲂生长性能增强、体质量显著增加，同时炎症因子TNF-α和IL-6表达量显著增加，而IL-1β表达无明显变化。注射嗜水气单胞菌后，与野生型不同的是，IL-6和TNF-α在SOCS1a~(+/-)和SOCS1b~(+/-)团头鲂的肝脏中的表达均有持续显著上升。本实验通过CRISPR/Cas9系统成功敲除了团头鲂socs1a和socs1b基因，为进一步探讨socs1基因的作用提供了一定的研究基础。同时，也为以养殖鱼类为对象，合理选用CRISPR/Cas9基因编辑技术提供了依据和借鉴。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
唐国盘 黄安群 孙志鹏 匡友谊 王胜杰 王大伟
比较三种常用的CRISPR/Cas9基因敲除检测变异方法,从准确性、耗时、成本和应用限制等方面进行评估。采用T7核酸内切酶I、限制性内切酶和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分别对利用CRISPR/Cas9方法敲除的fibinb和ngs基因的50尾斑马鱼(Danio rerio)突变纯合个体和突变杂合个体进行检测,用野生型个体作对照;同时用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对CRISPR/Cas9方法敲除的ogn和ddb1基因的突变杂合个体进行了检测。结果表明:三种方法均能够区分突变杂合个体,其中T7核酸内切酶I检测法耗时最短,但该方法不能用于鉴定突变纯合个体;限制性内切酶检测法能够用于鉴定纯合个体,但需要有特异性的识别位点;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法能够区分纯合和杂合个体,对序列无依赖性,能够检测出序列中存在的所有变异。成本上,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法最经济;限制性内切酶的价格存在较大的差异,因此检测成本依赖于酶的价格。三种检测方法各有优缺点,在应用实践中可根据试验需要选择合适的方法。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周磊 李东旭 冒魏佳 刘孜斐 时晓丽 高雪 万永杰
[目的]本文利用CRISPR/Cas9系统和先导编辑（PrimeEditor，PE）对湖羊骨骼肌卫星细胞中的肌肉生长抑制素Myostatin（MSTN）基因外显子进行敲除，旨在比较两种技术敲除MSTN基因的效率，并验证新型基因编辑工具PE用于湖羊骨骼肌卫星细胞上的可行性。[方法]针对湖羊 MSTN基因的三个外显子分别设计sgRNA（single guide RNA， sgRNA）以及pegRNA（prime editing guide RNA， pegRNA），构建出相应的质粒，然后，将含有Cas9/sgRNA或PE/pegRNA的质粒共同转染至湖羊骨骼肌卫星细胞中。24 h后观察细胞荧光，48 h后将细胞消化，使用流式细胞分选仪根据荧光强度筛选出转染成功的强阳性细胞，收集细胞获得基因组DNA进行桑格测序，检测两种基因编辑工具对MSTN基因的打靶效率。[结果]成功构建了分别针对湖羊骨骼肌卫星细胞MSTN基因三个外显子敲除的基因编辑工具，质粒测序结果显示序列插入正确；CRISPR/Cas9编辑效率（65%，88%和91%）显著高于先导编辑的编辑效率（57%，29%和33%），而先导编辑的indel比率显著低于常规的CRISPR/Cas9。[结论]在转染效率相近的情况下，常规CRISPR/Cas9相比于先导编辑对于湖羊骨骼肌卫星细胞MSTN基因敲除有更高的编辑效率。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
李伟杰 傅明骏 赵超 郭松 江世贵 周发林 杨其彬 邱丽华
为了研究细胞周期蛋白Y(cyclin Y)在斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢发育中的作用,从斑节对虾转录组数据中筛选获得cyclin Y基因部分序列,采用SMART-RACE方法克隆得到斑节对虾细胞周期蛋白Y(Pm-cyclin Y)基因c DNA全序列。Pm-cyclin Y基因c DNA全长1576 bp,其中包含108 bp的5′非编码区(5′UTR)和439 bp的3′非编码区(3′UTR)以及1029 bp的开放阅读框(ORF),可编码342个氨基酸。生物信息学分析显示,其编码的氨基酸序列有1个保守的周期蛋白框(cyclin box)同源结构域(172~257 aa),...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
赵超 傅明骏 江世贵 周发林 杨其彬 朱彩艳 邱丽华
为了解细胞周期蛋白E(cyclin E)基因在斑节对虾(Penaeus monodon)发育过程中的作用,构建和测序了斑节对虾全组织cDNA文库,获得了斑节对虾细胞周期蛋白(Pmcyclin)E的部分表达序列。通过RACE技术克隆得到1条全长1 706 bp的cDNA序列。Pmcyclin E开放阅读框(ORF)为1 263 bp,编码420个氨基酸。生物信息学分析表明,该氨基酸序列含有周期蛋白家族特有的CYCLIN保守区并含有N-糖基化位点及磷酸化位点。经BLAST同源性分析表明,该基因编码蛋白与红火蚁(Solenopsis invicta)、切叶蜂(Megachile rotundata)...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
李东昊 姜玲 刘春林 阮颖
以甘蓝型油菜‘湘油15号’为试材,通过生物信息学分析,运用CRISPR/Cas9系统对Bna SDG8第1个外显子上的Bna SDG8–A和Bna SDG8–C保守序列区域进行CRISPR/Cas9敲除位点设计,构建了CRISPR/Cas9敲除载体p CAMBIA1300–sg RNA/Cas9–Bna SDG8;通过遗传转化,获得转化植株19株;经测序比对,4株植株的Bna SDG8被成功编辑;通过对定向敲除植株开花时间的统计分析,初步确定Bna SDG8参与甘蓝型油菜开花时间的调控。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
陶英杰 刘凤娟 毕春晓 任雪冰 曲瑞红 李科友 徐全乐
【目的】克隆山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因（CASase）DNA全长序列，构建CRISPR/Cas9敲除载体，为筛选“低毒、高硫”山黧豆品系奠定基础。【方法】以萌发4 d山黧豆幼苗根部为材料，提取其基因组DNA，利用PCR克隆CASase基因全长；经序列同源性、内含子、外显子、sgRNA靶位点和脱靶分析后，在CASase cDNA上选取5个sgRNA靶位点进行寡核苷酸链设计和体外活性检测；从5个sgRNA靶位点中取活性较高的4个sgRNA，利用酶切连接法构建基因敲除载体pPLHACas9-sgRNA20r
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
姜爱文 郭鸿运 吴望军 刘红林
[目的]本文旨在利用Cas9蛋白/sgRNA体系，提高猪胎儿成纤维细胞的基因组编辑效率，为促进CRISPR/Cas9技术在猪上的广泛应用奠定基础。[方法]针对猪ROSA26位点的启动子区（包含第一外显子区）设计两条sgRNAs，并将其构建在PX459-Cas9-puro质粒上，以获得PX459-Cas9-sgRNA质粒。将sgRNA靶序列连同PAM序列构建在RGS-CR质粒上，以获得RGS-sgRNA质粒。使用PX459-Cas9-sgRNA质粒与RGS-sgRNA质粒系统共转染，筛选切割效率较高的一条sgRNA，并使用该sgRNA对猪胎儿成纤维细胞进行后续打靶实验。分别使用PX459-Cas9-sgRNA质粒和Cas9蛋白/sgRNA两种方法对猪胎儿成纤维细胞的靶位点进行基因敲除，将转染后的细胞提取基因组DNA，桑格尔测序检测打靶效率。[结果]成功构建了打靶猪ROSA26靶序列的PX459-Cas9-sgRNA质粒，及含PAM序列的RGS-sgRNA，且质粒测序结果显示序列插入正确；RGS-sgRNA筛选结果表明，sgRNA2的打靶效率极显著高于sgRNA1 (P < 0.01)，且sgRNA2无脱靶效应，因此后续使用PX459-Cas9-sgRNA2和Cas9蛋白/sgRNA2在猪胎儿成纤维细胞中进行打靶，并比较两者的打靶效率。在猪胎儿成纤维中，PX459-Cas9-sgRNA2质粒的打靶效率为16.67%，Cas9蛋白/sgRNA2体系的打靶效率为33.33%；[结论]Cas9蛋白/sgRNA体系较PX459-Cas9-sgRNA质粒提高了打靶效率约1倍，这对提高后续猪体细胞的基因敲入效率、促进基因编辑在猪上的应用有重要意义。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘丽华 沈卫德 李兵 王文兵
【目的】研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedroviruses,BmNPV)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞周期及细胞周期蛋白基因转录水平的影响。【方法】用BmNPV感染家蚕BmN细胞,分别在病毒感染后的不同时间(12,24,36,48h),应用实时荧光定量PCR方法检测细胞周期蛋白基因CyclinA、CyclinB、CyclinE的表达情况,用流式细胞仪检测细胞周期的变化。【结果】BmNPV感染24h后,BmN细胞出现明显感染症状,变为圆形;48h后细胞核内出现多角体。随着感染时间的延长,CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均下降,分别...
关键词：
BmNPV Cyclin基因 细胞周期
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