【目的】筛选介体灰飞虱(Laodelphax striatellus,SBPH)中与水稻条纹病毒(RSV)病害特异蛋白(disease-specific protein,SP)可能发生相互作用的蛋白质,为明确介体灰飞虱传播RSV的分子机制及SP在传毒过程中的作用打下基础。【方法】提取高质量灰飞虱总RNA并通过TaKaRa D9086 OligtexTM-dT30 mRNA Purification Kit对mRNA进行纯化。利用SMART技术合成双链cDNA,利用Axygen的PCR纯化回收试剂盒将ds cDNA回收纯化,纯化后的ds cDNA再经SfiⅠ限制性内切酶处理纯化后与文库载体pPR...

【目的】利用分离泛素酵母双杂交膜系统(split-ubiquitin yeast membrane system),以小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus,WDV)的外壳蛋白(CP)基因为诱饵对异沙叶蝉(Psammotettix alienus L.)c DNA文库进行筛选,研究异沙叶蝉传播WDV的分子机制。【方法】以笔者实验室饲养的异沙叶蝉为材料,提取其总RNA后取100 ng进行纯化,利用SMART法反转录合成ds c DNA,经过Sfi I酶切纯化,连接到p PR3-N文库载体上,构建得到以p PR3-N为载体的异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统c DNA文库。同时,构建带有S...

对来自江苏、云南、山东、河北等地灰飞虱来源的21个水稻条纹病毒分离物的病害特异性蛋白(sp)基因进行了遗传多样性分析研究。序列测定表明,所有分离物的sp基因大小相同,均由537个核苷酸组成,编码178个氨基酸和1个终止密码子。采用DNAStar软件进行分析,21个RSV分离物核苷酸和推导的编码蛋白氨基酸序列同源性分别为96.1%~100%和95.5%~100%。与已报道水稻来源的27个RSV分离物一起进行序列同源性比较和系统进化树分析,结果表明,RSV-sp基因核苷酸序列变异相对较大,除灰飞虱来源的或者云南来源的分离物相对独立成组外无明显的规律性。从功能上分析,其遗传多样性首先与寄主相关,从寄...

【目的】利用酵母双杂交系统在感病番茄中蔬四号中筛选分别与AvrPto、AvrPtoB互作的蛋白,研究AvrPto、AvrPtoB作为毒性因子在感病番茄中的作用通路。【方法】提取感病番茄中蔬四号的总RNA,合成中蔬四号cDNA文库,分别构建AvrPto和AvrPtoB的诱饵载体,从中蔬四号cDNA文库中筛选分别与AvrPto、AvrPtoB互作的蛋白,并对阳性克隆进行分析和鉴定。【结果】最终筛选到7个与AvrPto互作的蛋白,2个与AvrPtoB互作的蛋白,核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)羧化酶/加氧酶小亚基和AvrPto、AvrPtoB都能够互作,说明AvrPto、AvrPtoB参与破坏植物...

对虾白斑综合征病毒(WSSV)开放阅读框wsv112编码脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTP pyrophosphatase,dUTPase)。为研究wsv112与宿主的互作关系,本研究采用酵母双杂交Gal4系统从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肠道cDNA文库中筛选与wsv112互作的候选蛋白。以WSSV为模板,构建pGBKT7-112诱饵载体,转化到Y2H Gold酵母菌感受态细胞中,转化菌液涂布到不同缺陷型培养基上,检测诱饵载体的自激性和毒性。将凡纳滨对虾肠道cDNA文库与诱饵菌株pGBKT7-112接合,通过筛选力度不同的缺陷型培养基、颜色反应、PCR、测序鉴定等步骤筛选阳性克隆,将阳性菌株提取质粒,再经过回复杂交实验验证筛选出的阳性质粒与诱饵载体的作用。研究表明,诱饵载体pGBKT7-112无自激性和毒性,可用于酵母双杂交实验;经初筛和回复杂交实验最终得到2个阳性质粒,经过NCBI数据库对比,其编码的蛋白分别与日本囊对虾(Penaeus japonicus)C型凝集素(AGW27416.1)和克氏原螯虾(Procambarus clarkii)40S核糖体蛋白S20小亚基蛋白(ALE99171.1)具有37%和98%同源性。本研究为wsv112的调控机制提供新的线索。

【目的】辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）是世界范围内危害辣椒的主要病毒之一。126 kDa蛋白是PMMoV编码的重要致病因子，但致病机制目前仍不清楚。本研究旨在筛选与126 kDa蛋白互作的辣椒寄主因子，为解析PMMoV的致病机制提供理论依据。【方法】首先，通过同源重组法构建诱饵载体pGBK-126 kDa；并以辣椒叶片为试验材料，利用Trizol法提取辣椒叶片总RNA，制备辣椒酵母cDNA文库；之后，使用pGBK-126 kDa对cDNA文库进行筛选，并通过NCBI和Uniprot等对筛选结果进行序列比对和生物信息学功能分析，根据比对分析结果，选取可能参与到植物抗病通路的寄主因子，克隆其全长CDS构建到pGADT7载体，酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）和荧光素酶互补（LCI）进一步验证126 kDa与寄主因子之间的互作；最后，通过瞬时过表达寄主蛋白分析其在PMMoV侵染过程中的作用。【结果】提取获得高质量辣椒RNA，无降解；获得高质量酵母c DNA文库，成功构建诱饵质粒p GBK-126 kDa，筛选得到与126 kDa蛋白互作的辣椒寄主因子18个；生物信息学分析结果显示，18个寄主因子广泛参与到植物酶系统、物质及能量代谢调节过程、DNA结合转录过程、激素合成过程以及防御响应等多个通路；选取的其中3个寄主因子（LA2、PDHE1、BXL1）在一对一酵母双杂交互作验证中均存在与126 kDa的相互作用，表明初筛的结果可靠；通过Bi FC和LCI进一步验证了126 kDa与BXL1之间体内外互作；瞬时过表达BXL1发现PMMo V的侵染受到了显著抑制。【结论】成功构建了p GBK-126 kDa诱饵质粒，基于该质粒对酵母c DNA文库进行筛选得到18个互作的寄主因子，广泛涉及植物生命活动过程中的多个通路，筛选结果验证可靠，其中，BXL1存在与126k Da的体内外相互作用，并能够抑制PMMo V的侵染。研究结果可为深入探究PMMo V的侵染机制提供良好的理论和材料基础。

【目的】草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)是侵染草莓的主要病毒,但其侵染草莓的机制尚不清楚。论文以SVBV的P6蛋白为诱饵筛选森林草莓(Fragaria vesca)c DNA文库的寄主因子,为解析SVBV侵染草莓的分子机制提供理论依据。【方法】SVBV接种森林草莓,提取出现明显症状叶片的总RNA,Dnase I处理后,用SMART法反转录合成ds c DNA,均一化处理c DNA并酶切纯化,将1 kb,表明森林草莓c DNA文库符合试验标准。最终利用SD

【目的】绒毛白蜡是重要的盐碱地造林树种，挖掘绒毛白蜡的耐盐潜力，对推动黄河流域盐碱地生态保护和修复具有重要意义。CAMTA是植物抗逆胁迫信号通路中的重要转录激活因子，但绒毛白蜡盐胁迫信号途径中包括FvCAMTA1在内的大部分关键基因，尚未被克隆与鉴定，与FvCAMTA1发生互作的蛋白也不清楚，严重阻碍绒毛白蜡抗盐分子机理研究的瓶颈。本研究挖掘绒毛白蜡钙调素结合转录因子FvCAMTA1的互作蛋白，为解析其抗盐性机制奠定基础。【方法】采用酵母双杂交技术对其互作蛋白进行探究，提取绒毛白蜡‘盐蜡’新品种幼苗的总RNA，利用SMART技术合成ds cDNA，依据FvCAMTA1基因的CDS序列设计引物，通过PCR扩增出FvCAMTA1基因的编码序列(约2 700 bp)，构建重组诱饵载体pGBKT7-FvCAMTA1转化酵母菌株Y2HGold，并在缺陷型培养基上检测诱饵载体的毒性与自激活活性，筛选与绒毛白蜡钙调素结合转录因子FvCAMTA1互作的猎物蛋白，对部分互作蛋白进行了回补验证，并对互作的猎物蛋白进行Gene Ontology(GO)注释分析。【结果】成功构建了受盐诱导的绒毛白蜡全株幼苗的cDNA酵母双杂交文库，文库滴度为4.58×109CFU·mL~(-1)，插入片段长度为250～2 000 bp，重组率为100%。经检测诱饵载体无法自我激活也无毒性，所筛选的猎物蛋白经测序和Blast比对分析，并对其进行了共转验证，分离得到相互作用的46个阳性克隆。GO注释显示互作蛋白参与生物过程有11种，分子功能7种，细胞组分12种。研究结果补充和完善了FvCAMTA1的信号传递途径，为进一步研究绒毛白蜡钙调素结合转录因子FvCAMTA1及其共生互作蛋白的作用机制提供了新的分子证据。【结论】成功构建了绒毛白蜡酵母双杂交文库，为鉴定FvCAMTA1的互作蛋白并解析抗盐机理研究提供了重要理论依据。

【目的】绒毛白蜡是重要的盐碱地造林树种,挖掘绒毛白蜡的耐盐潜力,对推动黄河流域盐碱地生态保护和修复具有重要意义。CAMTA是植物抗逆胁迫信号通路中的重要转录激活因子,但绒毛白蜡盐胁迫信号途径中包括FvCAMTA1在内的大部分关键基因,尚未被克隆与鉴定,与FvCAMTA1发生互作的蛋白也不清楚,严重阻碍绒毛白蜡抗盐分子机理研究的瓶颈。本研究挖掘绒毛白蜡钙调素结合转录因子FvCAMTA1的互作蛋白,为解析其抗盐性机制奠定基础。【方法】采用酵母双杂交技术对其互作蛋白进行探究,提取绒毛白蜡‘盐蜡’新品种幼苗的总RNA,利用SMART技术合成ds cDNA,依据FvCAMTA1基因的CDS序列设计引物,通过PCR扩增出FvCAMTA1基因的编码序列(约2 700 bp),构建重组诱饵载体pGBKT7-FvCAMTA1转化酵母菌株Y2HGold,并在缺陷型培养基上检测诱饵载体的毒性与自激活活性,筛选与绒毛白蜡钙调素结合转录因子FvCAMTA1互作的猎物蛋白,对部分互作蛋白进行了回补验证,并对互作的猎物蛋白进行Gene Ontology(GO)注释分析。【结果】成功构建了受盐诱导的绒毛白蜡全株幼苗的cDNA酵母双杂交文库,文库滴度为4.58×109CFU·mL-1,插入片段长度为250～2 000 bp,重组率为100%。经检测诱饵载体无法自我激活也无毒性,所筛选的猎物蛋白经测序和Blast比对分析,并对其进行了共转验证,分离得到相互作用的46个阳性克隆。GO注释显示互作蛋白参与生物过程有11种,分子功能7种,细胞组分12种。研究结果补充和完善了FvCAMTA1的信号传递途径,为进一步研究绒毛白蜡钙调素结合转录因子FvCAMTA1及其共生互作蛋白的作用机制提供了新的分子证据。【结论】成功构建了绒毛白蜡酵母双杂交文库,为鉴定FvCAMTA1的互作蛋白并解析抗盐机理研究提供了重要理论依据。

小黑杨ＰｓｎＷＲＫＹ７０是能够响应盐胁迫的转录因子。为了进一步探究该转录因子在参与盐胁迫应答途径中与哪些蛋白质之间存在相互作用关系，本研究以１４０ ｍｍｏｌ／ｌ ｎａ Ｃｌ溶液处理过的小黑杨叶片为材料，利用热稳定核酸酶（Ｄｓｎ）构建了均一化的ＰＧａＤＴ７－ＤＥｓＴ酵母双杂交ＣＤｎａ文库，将ＰｓｎＷＲＫＹ７０基因亚克隆至ＰＧＢＫＴ７载体，形成ＢＤ－ＷＲＫＹ重组质粒，并以之为诱饵蛋白表达载体筛选小黑杨酵母双杂交ＣＤｎａ文库。经过２轮酵母双杂交筛选以及回转验证试验，初步选出了５种与ＰｓｎＷＲＫＹ７０相互作用的蛋白质。对所筛选出的５种蛋白质进行保守结构域分析发现：有２种预测蛋白（ＨＰ１和ＨＰ２，其中Ｈ．．．

【目的】检测灰飞虱体内由水稻条纹病毒(RSV)编码的外壳蛋白(CP)、病害特异性蛋白(SP),以及非结构蛋白NS2、NS3和NSvc4等5种蛋白以及病毒粒子CP与SP、NS2、NS3、NSvc4的体外结合,为进一步研究水稻条纹病毒与其介体昆虫互作提供有用信息。【方法】提取高带毒灰飞虱(Q家系)总蛋白,用免疫方法检测昆虫体内CP、SP、NS2、NS3和NSvc4等5种重要蛋白的表达以及病毒粒子CP与SP、NS2、NS3、NSvc4的体外结合情况。【结果】结果表明在带毒灰飞虱体内以上5种蛋白都能检测到,而且CP含量最高,NSvc4、SP、NS3、NS2含量依次降低;用体外原核表达后纯化的蛋白进行了...

[目的]本文旨在鉴定香蕉果实后熟关键调控因子MaMADS2的互作蛋白，深入解析MaMADS2影响香蕉果实后熟过程的分子机制。[方法]以MaMADS2为诱饵利用酵母双杂交文库获得候选互作蛋白，通过克隆候选互作基因编码区进行点对点酵母双杂交试验来验证互作情况；利用转录组学分析互作蛋白相关基因在后熟过程中的表达情况；利用双分子荧光互补试验鉴定重要互作蛋白与MaMADS2的互作；最后用蛋白免疫印迹分析MaMADS2蛋白在香蕉后熟过程中的表达。[结果]成功构建了果实在乙烯利催熟下的cDNA文库，初级和次级文库的库容分别为2.9×10~6和3.2×10~6 CFU·mL~(-1),平均插入片段大小在1 200 bp以上，可满足后续酵母双杂交筛选的要求。最终共鉴定出7个互作蛋白，其中有2个MADS-box转录因子，3个E3泛素连接酶，2个具有转录抑制作用的蛋白。转录组数据表明，乙烯利可抑制2个MADS-box基因的表达，而1-甲基环丙烯(1-MCP)对其表达起诱导作用。双分子荧光互补试验表明，MaMADS2与MADS-box转录因子Ma04＿p30020.1存在互作关系。蛋白免疫印迹分析显示，MaMADS2在后熟过程中蛋白水平逐渐降低，这与其可以和E3泛素连接酶互作是一致的。[结论]通过构建高质量的果实cDNA文库与酵母双杂交筛库技术，鉴定出多个与MaMADS2互作的蛋白，并明确了MaMADS2与另一MADS-box转录因子Ma04＿p30020.1之间存在明显的互作关系。

[目的]从番木瓜4个不同成熟期果实的转录组中筛选并克隆得到1个转录因子CpMYB114L,构建番木瓜果实的cDNA文库,筛选与CpMYB114L互作的蛋白,探究CpMYB114L参与调控果实成熟的分子机理。[方法]以番木瓜‘GZBG’品种的果实为材料,设计特异引物,克隆CpMYB114L CDS区,利用生物信息学软件分析该基因序列及其编码的蛋白序列。提取番木瓜不同成熟期果实的总RNA,利用all-direct法建立酵母双杂交cDNA文库。构建pGBKT7-CpMYB114L诱饵载体,对其自激活检测后,通过共转化从文库中筛选CpMYB114L互作蛋白。通过在NCBI网站上进行序列比对,明确互作蛋白的功能分类,最后对各类蛋白基因在番木瓜不同成熟期果实中的表达进行分析。[结果]CpMYB114L基因的CDS序列编码227个氨基酸,预测其相对分子质量为26 304.3,理论等电点为6.23,亲水性总平均值为-0.893。CpMYB114L蛋白序列与甜樱桃(PaWERL)、蒺藜苜蓿(MtMYB1)、黧豆(MpMYB113)、大豆(GmMYB1)和苹果(MdMYB308L)的同源性较近。cDNA文库总库容为1.15×10~7 CFU,重组率100%,插入片段长度为750～2 000 bp。诱饵载体pGBKT7-CpMYB114L不存在自激活。从酵母双杂交文库中筛选到30个初始阳性克隆,经回转验证后最终获得26个与CpMYB114L互作的蛋白,共分为4类,包括乙烯响应受体1(CpERS1)、酰基辅酶A硫酯酶13(CpAcots13)、热休克蛋白42(CpHSP42)和叶绿体转运子159 (CpTOC159)。在果实成熟过程中,CpERS1和CpHSP42表达量先上升后下降,CpAcots13表达量持续上升,CpTOC159表达量剧增后趋于平稳。[结论]推测CpMYB114L与CpERS1蛋白互作参与番木瓜果实成熟的调控。

【目的】应用酵母双杂交技术构建新城疫病毒的血凝素－神经氨酸酶（ＨＮ）蛋白线性中和表位区的诱饵载体ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅｕ，为筛选靶向新城疫病毒ＨＮ蛋白的中和性纳米抗体奠定基础。【方法】合成ＨＮ蛋白的线性中和表位区ＨＮ－Ｎｅｕ，将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体ｐＧＢＫＴ７中，构建诱饵载体ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅｕ，经酶切鉴定和测序验证正确后，将ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅｕ转化酵母菌Ｙ２Ｈ Ｇｏｌｄ，检测其在酵母细胞中的毒性和自激活作用。【结果】成功合成了ＨＮ－Ｎｅｕ，构建的ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅｕ在酵母细胞Ｙ２Ｈ Ｇｏｌｄ中无毒性和自激活能力。【结论】成功构建了诱饵载体ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅ．．．

采用TRIzol法提取绵羊卵巢组织总RNA，运用RT–PCR技术扩增绵羊微管解聚蛋白基因(STMN1)的编码区序列；通过同源重组技术构建重组诱饵表达载体p GBKT7–STMN1，鉴定该诱饵蛋白在酵母双杂交系统中的自激活活性、细胞毒性和表达情况；利用诱饵质粒p GBKT7–STMN1从绵羊卵巢组织细胞的酵母双杂交cDNA文库筛选互作的宿主蛋白。结果显示：成功构建重组诱饵质粒p GBKT7–STMN1，并对酵母细胞无自激活活性和细胞毒性作用，且能在酵母细胞中正常表达；筛选获得12个与STMN1相互作用的克隆，经测序比对分析和点对点验证，得到CREB和FOXM1共2个互作的宿主蛋白，这2个蛋白可能参与调控细胞的增殖、周期、凋亡等过程。