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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
丁修虎 丁强 王悦 夏淑雯 赵芳 陈坤琳 吴家顺 何南 仲跻峰 王慧利 李惠侠
[目的]β-乳球蛋白是由BLG基因编码的蛋白质，是牛乳中主要的过敏原。本试验旨在使用优化后的CBE单碱基编辑器YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因进行单碱基编辑，同时对两种单碱基编辑器在牛胚胎BLG基因敲除效果进行评价。[方法]在奶牛的BLG基因的第一外显子上设计sgRNA序列，通过胞嘧啶碱基编辑器将BLG基因第21位密码子CAG突变为TAG实现c*.61C>T（p.Q21*）的转变，获得终止密码子，使蛋白质翻译提前终止，达到基因敲除的目的。通过体外转录获得sgRNA和YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max的mRNA，显微注射到奶牛胚胎中。收集囊胚进行胚胎基因组扩增，PCR扩增BLG基因目标序列并进行测序验证编辑效率。根据sgRNA的序列，全基因组选择错配碱基最少的5个潜在脱靶位点进行脱靶检测。[结果]分别检测20枚YE1-BE3-FNLS编辑囊胚和24枚YE1-AncBE4max编辑囊胚，PCR测序，YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因的靶向编辑效率为79.17%（19/24）高于YE1-BE3-FNLS的靶向编辑效率60%（12/20），而前者存在较大的编辑窗口，可对sgRNA序列上的多个胞嘧啶进行编辑（C1-C9），后者具有较小的编辑窗口为C2-C4；另外，YE1-BE3-FNLS具有较高的靶位点双链编辑效率35%（7/20），而YE1-AncBE4max只有2枚编辑胚胎发生双链编辑，纯合编辑率较低；经分析，两种单碱基编辑器制备的编辑胚胎均未出现插入缺失和脱靶效应。[结论]本文使用的两种胞嘧啶碱基编辑器均能高效制备奶牛BLG基因编辑胚胎，为进一步获得BLG基因单碱基敲除奶牛储备技术方法。
[期刊] 水产学报
[作者]
赵心愉 刘娟 邹曙明
细胞因子信号传导抑制蛋白1（SOCS1）是一种重要的负反馈调节因子，广泛参与调控多种细胞因子介导的信号通路，在免疫系统的调节和生物体的生长发育过程中都发挥着至关重要的作用。本实验以已获得的团头鲂socs1a和socs1b基因为编辑对象，在线分析筛选出合适的靶点合成gRNA（guide RNA），然后对1～2细胞期的团头鲂胚胎进行gRNA和Cas9蛋白的混合注射。通过荧光定量PCR在转录水平鉴定socs1a和socs1b的表达和测序在DNA水平鉴定基因的序列突变，成功建立了多种socs1的突变品系。与同期野生型（WT）相比，SOCS1a~(+/-)和SOCS1b~(+/-)团头鲂生长性能增强、体质量显著增加，同时炎症因子TNF-α和IL-6表达量显著增加，而IL-1β表达无明显变化。注射嗜水气单胞菌后，与野生型不同的是，IL-6和TNF-α在SOCS1a~(+/-)和SOCS1b~(+/-)团头鲂的肝脏中的表达均有持续显著上升。本实验通过CRISPR/Cas9系统成功敲除了团头鲂socs1a和socs1b基因，为进一步探讨socs1基因的作用提供了一定的研究基础。同时，也为以养殖鱼类为对象，合理选用CRISPR/Cas9基因编辑技术提供了依据和借鉴。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李景芬 于浩 袁野 刘娣
【目的】获得敲除肌肉生长抑制素(MSTN)基因的猪胎儿成纤维细胞。【方法】打靶载体的构建:以Neo为正筛选基因、HSV-tk为负筛选基因。在Neo的两侧分别插入同源长臂和同源短臂。同源长臂5382bp,包含MSTN基因的部分5′端,全部的exon1,intron1和exon2及大部分intron2;同源短臂844bp,包含部分exon3及3′端的部分序列。取35d胎龄的大白猪,用胰酶消化法,分离胎儿成纤维细胞并对其进行培养和建系。采用脂质体法将打靶载体导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用250μg·ml-1G418筛选7d,再用200μg·ml-1G418+2μmol·L-1GANC维持筛选...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵丽华 梁浩 云亭 李荣凤
【目的】构建两套用于牛肌肉生长抑制素(myostation,MSTN)基因敲除的置换型打靶载体。【方法】设计并合成含有限制性内切酶酶切位点的引物,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)以牛耳皮肤组织基因组DNA为模板分别扩增出两套打靶载体的同源短臂和长臂,再分别插入到两套打靶专用基础载体pMCS-PLP和PⅢ中,构建两套用于牛MSTN基因敲除的置换型打靶载体pPLP-MSTN和PⅢ-MSTN。【结果】经过PCR、T载体连接和DNA测序,证实载体pPLP-MSTN包含2.8 kb同源短臂和4.0 kb同源长臂,载体PⅢ-MSTN包含1.3 kb同源短臂和...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
原海亮 管仁艳 何璟
为了阐明ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅＳ Ｓａｈａｃｈｉｒｏｉ ａｔｃｃ ３３１５８中Ⅲ型聚酮合酶基因ｏｒｆ１８的功能，利用同源双交换的方法对该基因进行同框敲除，采用异位表达的方法进行了相应的回补实验。通过高效液相色谱及液相色谱－质谱联用分析发现基因ｏｒｆ１８的敲除会明显降低发酵产物中苯甲酸盐的含量，回补该基因能够在一定程度上恢复苯甲酸盐的产量，表明ｏｒｆ１８在原宿主中极有可能参与苯甲酸盐的生物合成。
[期刊] 华北农学报
[作者]
游雷鸣 罗俊 王爱萍 张改平 卜丹 郭亚男 祈艳华
从鸡B淋巴DT40细胞系中克隆-βactin启动子,替换pCDNA3.1(+)载体中的SV40启动子,构建-βactin启动子驱动的Neomycin抗性基因表达框。将克隆的sIgMλ轻链基因两侧各约2 kb的序列插入到抗性表达框的两侧作为同源臂。PCR、酶切以及测序结果表明成功构建了靶向sIgMλ轻链基因的置换型打靶载体pCDNA-act-neo-HR。为建立sIgMλ轻链基因敲除的DT40细胞模型,探究sIgMλ轻链在IBDV感染DT40细胞过程中的作用奠定了基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王丹丹 唐雨婷 马月辉 王立刚 潘登科 蒋琳
【目的】ZBED6基因是一个调控肌肉生长发育的转录因子,为了探讨ZBED6在心肌生长发育中的调控机制,利用RNA Sequencing(RNA-Seq)技术比较ZBED6基因敲除巴马小型猪(ZBED6-KO)和同日龄正常巴马小型猪(ZBED6-WT)的心脏组织转录组,挖掘ZBED6基因的敲除对家猪心脏组织发育及基因表达的影响。【方法】利用t-test对ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织大小的表型特征进行显著性分析,利用实时荧光定量PCR对ZBED6基因的靶基因IGF2的表达量进行定量。通过制作
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
黄振玉 竹个个 邹华锋 吕为群
细胞周期蛋白M2(CNNM2)是参与体内镁离子平衡的重要候选基因,实验采用的CRISPR/Cas9系统是近几年发展起来的一类新型基因打靶技术。在斑马鱼CNNM2基因的一号外显子处选取打靶位点,构建sgRNA表达载体。随后将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA混合物分别以约30 pg和300 pg的剂量显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中实现对目的靶基因CNNM2的敲除。24~48 h后PCR产物回收,限制性酶切法初步检测基因打靶情况,最后进行测序分析确定突变类型。为进一步验证突变的稳定遗传性,选择了具有敲除效率的F0与野生型斑马鱼进行外交,对获得的F1进行逐一剪尾,提取DNA进行PCR和测序...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
黄振玉 竹个个 邹华锋 吕为群
细胞周期蛋白Ｍ２（ＣＮＮＭ２）是参与体内镁离子平衡的重要候选基因，实验采用的ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ９系统是近几年发展起来的一类新型基因打靶技术。在斑马鱼ＣＮＮＭ２基因的一号外显子处选取打靶位点，构建ＳｇＲＮａ表达载体。随后将体外转录的ＳｇＲＮａ和ＣａＳ９ ＭＲＮａ混合物分别以约３０ Ｐｇ和３００ Ｐｇ的剂量显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中实现对目的靶基因ＣＮＮＭ２的敲除。２４～４８ ｈ后ＰＣＲ产物回收，限制性酶切法初步检测基因打靶情况，最后进行测序分析确定突变类型。为进一步验证突变的稳定遗传性，选择了具有敲除效率的Ｆ０与野生型斑马鱼进行外交，对获得的Ｆ１进行逐一剪尾，提取ＤＮａ进行ＰＣＲ和测序．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
白玉 许晓东
【目的】利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选建立苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子lef10点突变载体，为进一步研究AcMNPV lef10的功能提供参考。【方法】 利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选BAC修饰系统对AcMNPV lef10进行点突变，由于lef10和必需基因vp1054有重叠，所以在敲除lef10时只能通过引进点突变使lef10失活，避免影响vp1054的正常表达。首先，构建rpsLAMP筛选盒，然后在野生型AcBacmid中引进点突变，方法是通过2次Red/ET重组：第1次重组在野生型AcBacmid lef10中引进rpsLAMP抗性筛选标记...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
白玉 许晓东
【目的】利用Ｒｅｄ／ｅＴ系统结合ＲｐｓＬ反向筛选建立苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＭＮｐＶ）晚期表达因子Ｌｅｆ－１０点突变载体，为进一步研究ＡｃＭＮｐＶＬｅｆ－１０的功能奠定基础。【方法】利用Ｒｅｄ／ｅＴ系统结合ＲｐｓＬ反向筛选ＢＡｃ修饰系统对ＡｃＭＮｐＶ Ｌｅｆ－１０进行点突变，由于Ｌｅｆ－１０和必需基因Ｖｐ１０５４有重叠，所以在敲除Ｌｅｆ－１０时只能通过引进点突变使Ｌｅｆ－１０失活，避免影响Ｖｐ１０５４的正常表达。首先，构建ＲｐｓＬ－ＡＭｐ筛选盒，然后在野生型ＡｃＢＡｃＭｉｄ中引进点突变（方法是通过２次Ｒｅｄ／ｅＴ重组：第１次重组在野生型ＡｃＢＡｃＭｉｄ Ｌｅｆ－１０中引进ＲｐｓＬ－ＡＭ．．．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周磊 李东旭 冒魏佳 刘孜斐 时晓丽 高雪 万永杰
[目的]本文利用CRISPR/Cas9系统和先导编辑（PrimeEditor，PE）对湖羊骨骼肌卫星细胞中的肌肉生长抑制素Myostatin（MSTN）基因外显子进行敲除，旨在比较两种技术敲除MSTN基因的效率，并验证新型基因编辑工具PE用于湖羊骨骼肌卫星细胞上的可行性。[方法]针对湖羊 MSTN基因的三个外显子分别设计sgRNA（single guide RNA， sgRNA）以及pegRNA（prime editing guide RNA， pegRNA），构建出相应的质粒，然后，将含有Cas9/sgRNA或PE/pegRNA的质粒共同转染至湖羊骨骼肌卫星细胞中。24 h后观察细胞荧光，48 h后将细胞消化，使用流式细胞分选仪根据荧光强度筛选出转染成功的强阳性细胞，收集细胞获得基因组DNA进行桑格测序，检测两种基因编辑工具对MSTN基因的打靶效率。[结果]成功构建了分别针对湖羊骨骼肌卫星细胞MSTN基因三个外显子敲除的基因编辑工具，质粒测序结果显示序列插入正确；CRISPR/Cas9编辑效率（65%，88%和91%）显著高于先导编辑的编辑效率（57%，29%和33%），而先导编辑的indel比率显著低于常规的CRISPR/Cas9。[结论]在转染效率相近的情况下，常规CRISPR/Cas9相比于先导编辑对于湖羊骨骼肌卫星细胞MSTN基因敲除有更高的编辑效率。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘卿 梁运祥 葛向阳
在腊样芽胞杆菌DNF409中,narGHJI基因负责编码呼吸过程中硝酸盐还原酶基因nar的α、β、γ、δ四个亚基。通过基因同源重组的方法,利用一段带有终止序列和Ω环的链霉素抗性片段,取代nar中的部分基因片段,实现硝酸盐还原酶的基因敲除,从而得到专一降解亚硝酸盐的突变体菌株,其硝酸盐还原酶的活性降低了80%。该菌与DNF409共同使用,可解除DNF409单独使用时亚硝酸盐严重积累的现象。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
彭梅芳 甘凤 潘春梅 宋健兰 范晓丽 陈克贵
【目的】在植物转基因研究中,使用选择标记基因(Selectable Marker Gene, SMG)使得转化子的筛选更准确便利,但存在SMG的转基因植株可能对人类健康及生态环境造成潜在危害,这也限制了转基因植物商业化的应用前景。因此去除转基因植物中的SMG十分必要。【方法】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对水稻转基因中常用的SMG潮霉素抗性基因(hygromycin phosphotransferase II,hptII)设计构建了编辑载体,利用农杆菌(LBA4404)介导的遗传转化方法转化水稻日本晴,得到转化植株,再将转化植株与带有hptII基因的植株进行杂交。【结果】通过遗传转化及分子鉴定,本研究得到了18株可用于编辑hptII基因的转化植株,进一步对转化植株与带有hptII基因的植株杂交的F_1代进行检测,经PCR检测及测序验证表明,在杂交F_1代植株中,hptII基因的DNA确有编辑发生,包括碱基缺失、替换以及插入等,使得hptII基因不能成功转录。【结论】利用CRISPR/Cas9技术,成功获得了删除hptII基因的转基因水稻。这为植物转基因研究实现无选择标记基因(marker-free)奠定了基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
魏迎辉 刘志国 徐奎 Evanna Huyhn Paul Dyce 李继良 周伟良 董树仁 冯保亮 牟玉莲 Ju LangLi 李奎
【目的】猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗称"蓝耳病",是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种高致死性传染病,对世界养猪业造成了巨大的经济损失。由于PRRSV遗传变异性较大,因此国内外并未有理想疫苗能够对此病进行有效防制。Cluster of differentiation 163(CD163)是PR
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