基于微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)平台,以转基因玉米为例,建立了转基因作物(Genetically modified crops,GM crops)外源基因拷贝数分析方法,对待测样品进行了快速鉴定,并从T_0转基因玉米株系中鉴定出多个单拷贝单株。对该方法与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法在分析结果的准确性方面进行了比较,从试验数据可以看出,2种检测方法的结果比较一致,单拷贝检测结果高度一致;但是ddPCR

为鉴定抗除草剂转基因大豆新品种‘GE-J12’的外源基因插入拷贝数,以该转化体的外源插入目的基因G2-EPSPS和GAT的序列、3′转化体特异性序列为靶序列,设计PCR扩增引物和TaqMan探针,并对引物探针特异性进行鉴定,同时以大豆内标基因Lectin为参照,建立微滴数字PCR拷贝数检测体系。特异性试验结果显示,只有以抗除草剂转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板才有扩增信号。以单株转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板,进行外源目的基因G2-EPSPS和GAT、3′转化体特异性序列的微滴数字PCR检测,转基因大豆‘GE-J12’的外源目的基因G2-EPSPS和GAT在基因组上的插入拷贝数均值分别为0.99和1.01。同时3′转化体特异性序列的拷贝数均值为1.00,验证单株转基因大豆‘GE-J12’为纯合子,因此鉴定该单株转基因大豆‘GE-J12’的外源基因在大豆基因组上为单拷贝插入,同时与Southern blot方法进行比较,结果一致。

【目的】本研究是从前期获得的100余份转基因抗除草剂草甘膦玉米品系中,挑选T抗-1等14个转基因玉米品系进行拷贝数检测。【方法】采用一种新型的拷贝数分析方法——微滴数字PCR技术(droplet digital PCR,简称dd PCR),设计特异引物对外源抗草甘膦基因2m G2-epsps进行绝对定量分析。【结果】供试的14份转基因材料中10份是单拷贝品系。同时,通过引物探针特异性试验、叶片基因组DNA的PCR抑制和浓度检测、转基因玉米的外源基因2m G2-epsps的实时PCR检测和基因组DNA的酶切

【目的】培育抗玉米螟、抗草甘膦、抗旱的转基因复合性状玉米种质。【方法】通过农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化法,把重组到同一植物表达载体的cry1Ac M、epsps、GAT和Zm PIS转入玉米骨干自交系9801和齐319(Q319),获得转基因植株。通过逐代除草剂筛选、分子检测和抗虫性鉴定,从大量转基因株系中优选出6个优良玉米株系。在此基础上,以非转基因自交系9801、Q319为对照,在严格控制条件下对6个转基因株系进行抗虫、抗除草剂和抗旱性检测。由于不同生长时期植株对玉米螟危害的敏感程度有差异,在抗虫性检测试验中,对不同生长阶段的转基因玉米的抗虫性,分别进行了田间和室内玉米螟接种试验,并以灌浆...

杂草危害已成为玉米(Zea mays L.)栽培中的一大难题,采用常规人工拔草的方式去除杂草存在操作麻烦、成本高等问题,而培育抗除草剂转基因玉米是解决这一问题的有效途径。为了获得生产中可用的抗草丁膦(phosphinothricin,PPT)除草剂的优良转基因玉米,本研究通过基因枪法将p35SIH3X质粒上的bar基因导入了优良玉米自交系18-599红幼胚诱导的愈伤组织。转化后的愈伤组织经过在含Bialaphos浓度(以有效成分PPT计算)为6,10,15mg.L-1的选择培养基中筛选3次以后进行分化,长出的小苗再经炼苗后移栽至大田,最后得到长大成活植株75株,结实收获8株。通过PCR(pol...

本研究以台湾褐色菜鸭为试验动物，采用荧光定量ＰＣＲ技术，使用２－ΔΔＣｔ换算法对ＰＲＬＲ基因拷贝数进行定量，分析了其多态性与台湾褐色菜鸭生产性能的相关性．结果表明，ＰＲＬＲ和Ｌｄｈ－Ｂ标准曲线的Ｒ２分别为０．９９１和０．９９０，扩增效率分别为１１１．６８％和１０８．４２９％，斜率分别为－３．０７０和－３．１３５，ＰＲＬＲ和Ｌｄｈ－Ｂ的扩增效率近似一致，可通过２－ΔΔＣｔ方法对ＰＲＬＲ基因进行定量分析．在９４羽台湾褐色菜鸭的样品中共检测到５种拷贝数（１、２、３、４、５）变异类型，拷贝数变异与台湾褐色菜鸭的蛋壳厚度和蛋形指数显著相关（Ｐ＜０．０５），拷贝数为２的个体蛋壳厚度显著高于拷贝数为１和５的．．．

在室内条件下,研究转基因抗虫、耐除草剂复合性状玉米NF6373YGRR(通过杂交育种聚合cry1A.105、cry2Ab2、cp4epsps基因)对亚洲玉米螟[Ostrinia furnacalis(Guenee)]初孵幼虫和3龄幼虫取食行为与存活率的影响。结果表明:在48h非选择性试验中,玉米螟初孵幼虫在转基因玉米心叶组织上的取食率显著低于非转基因玉米,转基因玉米48h的幼虫累计死亡率为53.75%,非转基因玉米为20.00%,差异显著;3龄幼虫在转基因玉米雌穗尖组织上的取食率、死亡率与非转基因玉米差异不显著。在48h选择性试验中,初孵幼虫在转基因玉米心叶组织上的取食率显著低于非转基因玉米,...

抗除草剂基因的研究和利用浙江农业大学农学系赵彬除草剂必须识别作物和杂草，才能在农田中安全有效地使用。然而，除草剂消灭杂草而不伤害作物的选择性是很难获得的特性，因为除草剂所影响的植物生理生化过程，如光合作用和氨基酸的生物合成，对作物和杂草是共同的。目前...

拷贝数变异(Copy number variation,CNV)是一种重要的基因组结构变异,主要指从几kb到数个Mb范围内DNA的多态,包括片段插入、缺失、重复等,它是研究基因组进化和表型差异的重要因素。CNV最早在人类基因组上发现,近几年,在鼠、猪、牛等动物基因组上的研究也取得了明显成效。文章阐述了生物遗传变异的2种方式CNV和单核苷酸多态性,对CNV的形成机制和检测方法进行了分析,重点介绍了畜禽基因组CNV的研究现状,并就CNV未来的研究重点和需要解决的问题进行了展望。

为了解转基因家蚕在杂交转育和累代选育过程中,外源基因在基因组上的整合位点和拷贝数变化情况,通过反向PCR和southern杂交,测定外源基因在杂交一代和三代品系的拷贝数与插入位点。反向PCR结果显示,所有样品均只扩增出一条片段,且大小一致。对扩增片段进行克隆测序和比对发现,外源基因均系插入同一位点,位于24号染色体。Southern blotting试验结果表明各试验样品均得到了较好的一条杂交信号,而对照没有杂交信号,说明外源基因在各个样品中均系单拷贝插入,而且插入的位置没有随着转育和传代培养而发生变化。研究结果表明外源基因可稳定遗传,将此转基因材料与常规品种材料进行杂交,选育优良家蚕品种的方...

【目的】探索中间锦鸡儿基因组中FAD2基因的拷贝数,分析不同拷贝的表达模式,以期揭示不同拷贝在植物体内的功能分工。【方法】根据中间锦鸡儿(Caragana intermedia)FAD2基因的保守序列设计1对引物SF和SR,利用该引物对PCR扩增制备114 bp的Southern检测探针,探针进行地高辛标记后,采用罗氏Southern杂交试剂盒进行Southern检测。根据中间锦鸡儿3个FAD2基因各自的特异差异序列,分别设计定量PCR引物序列,以actin基因为内参,对中间锦鸡儿的根、茎、叶及不同发育时期(发芽15,25,35 d)种子的cDNA进行定量PCR分析。【结果】中间锦鸡儿FAD2...

【目的】批准进口的转基因玉米NK603是中国转基因生物安全监管的主要对象。转基因安全监管需要标准物质和标准检测方法,建立转基因玉米NK603的数字PCR(dPCR)方法将为转基因玉米NK603的定量检测和标准物质研制提供精准测量技术。【方法】采用人工合成技术构建标准质粒分子pUC57-NK603;将NK603转化体与不同的玉米内标基因引物/探针一一组合,遴选与NK603转化体特异性PCR具有相同扩增能力的玉米内标基因PCR方法;设置二重微滴数字PCR(ddPCR)的退火温度梯度和引物/探针浓度梯度,优化二重ddPCR的反应体系和反应条件;用梯度稀释的标准质粒溶液作模板,考察二重ddPCR的检测极限、定量极限和动力学范围;将转基因玉米NK603种子粉末和非转基因玉米种子粉末混合,配制质量分数分别为100%、10%和6%的盲样,考察二重ddPCR的定量准确性。【结果】用标准质粒分子pUC57-NK603作为二重ddPCR的质控对照,通过考察二重ddPCR反应热图的微滴信号强度、阳性微滴与阴性微滴分辨率、雨滴数量、NK603转化体与内标基因拷贝数比值测量值与预期值的一致性,确定将NK603转化体特异性PCR方法与内标基因zSSIIb PCR方法组合,建立NK603/zSSIIb二重ddPCR方法。二重ddPCR反应体系中NK603转化体和zSSIIb内标基因的引物/探针浓度相同,均为400 nmol·L-1/200nmol·L-1,在60℃退火延伸。NK603/zSSIIb二重ddPCR的检测极限是2 copies DNA模板,定量极限是48 copies DNA模板,动力学范围是10—60 000 copies DNA。应用NK603/zSSIIb二重ddPCR方法可准确定量玉米盲样中的NK603转化体含量,定值结果变异系数小于25%;dPCR定量结果与荧光定量PCR(qPCR)定量结果无显著差异,且具有更高的精确性。【结论】内标基因的选择会影响dPCR定量结果的准确性,在建立dPCR方法的过程中,要用具有准确量值的样品作为质控对照,评估内标准基因的适用性。以人工合成的标准质粒分子pUC57-NK603为质控对照,建立了NK603/zSSIIb二重ddPCR方法。应用建立的二重ddPCR定值方法进行标准物质的研制和定值,已成功研制出转基因玉米NK603有证标准物质。