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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
原海亮 管仁艳 何璟
为了阐明StreptomyceS Sahachiroi atcc 33158中Ⅲ型聚酮合酶基因orf18的功能,利用同源双交换的方法对该基因进行同框敲除,采用异位表达的方法进行了相应的回补实验。通过高效液相色谱及液相色谱-质谱联用分析发现基因orf18的敲除会明显降低发酵产物中苯甲酸盐的含量,回补该基因能够在一定程度上恢复苯甲酸盐的产量,表明orf18在原宿主中极有可能参与苯甲酸盐的生物合成。
[期刊] 华北农学报
[作者]
韩政宏 段宇轩 徐善斌 王敬国 刘化龙 杨洛淼 贾琰 辛威 郑洪亮 邹德堂
为促进长粒型粳稻品种的选育,以粳稻品种东富139、龙粳31和东农427为试验材料,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA和pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA 2个敲除载体,通过农杆菌转化法侵染受体材料的愈伤组织,对GS3和GS9基因进行定点编辑。最终,3个品种在T_2都获得了GS3单基因突变、GS9单基因突变和GS3、GS9双基因突变,且无T-DNA元件的纯合植株。在成熟期对T_2突变体及其野生型的农艺性状进行考察分析,结果表明,与野生型相比,3个品种的gs3突变植株的粒长、千粒质量均显著增加,粒宽、结实率和穗粒数无显著变化;gs9突变体粒长显著增加,粒宽显著减少,千粒质量、结实率和穗粒数无显著变化;gs3gs9突变体粒长增加,且增幅大于gs3和gs9,同时粒宽显著减少,千粒质量显著增加,而结实率和穗粒数无显著变化。综上,利用CRISPR/Cas9技术对东富139、龙粳31和东农427等3个粳稻品种的粒型进行改良,加快了长粒型粳稻新品种的选育进程。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
彭梅芳 甘凤 潘春梅 宋健兰 范晓丽 陈克贵
【目的】在植物转基因研究中,使用选择标记基因(Selectable Marker Gene, SMG)使得转化子的筛选更准确便利,但存在SMG的转基因植株可能对人类健康及生态环境造成潜在危害,这也限制了转基因植物商业化的应用前景。因此去除转基因植物中的SMG十分必要。【方法】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对水稻转基因中常用的SMG潮霉素抗性基因(hygromycin phosphotransferase II,hptII)设计构建了编辑载体,利用农杆菌(LBA4404)介导的遗传转化方法转化水稻日本晴,得到转化植株,再将转化植株与带有hptII基因的植株进行杂交。【结果】通过遗传转化及分子鉴定,本研究得到了18株可用于编辑hptII基因的转化植株,进一步对转化植株与带有hptII基因的植株杂交的F_1代进行检测,经PCR检测及测序验证表明,在杂交F_1代植株中,hptII基因的DNA确有编辑发生,包括碱基缺失、替换以及插入等,使得hptII基因不能成功转录。【结论】利用CRISPR/Cas9技术,成功获得了删除hptII基因的转基因水稻。这为植物转基因研究实现无选择标记基因(marker-free)奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘来鑫 樊圃
[目的]探究色氨酸羟化酶2(Tph2)基因敲除对雄性大鼠焦虑、抑郁样行为和社交行为的影响,为进一步研究五羟色胺(5-HT)系统对大鼠生长发育及行为的调控机制提供参考。[方法]以SD背景的雄性大鼠为研究对象,采用高效液相色谱串联高分辨质谱检测成年野生型大鼠(WT)和Tph2基因敲除(第6外显子(98 bp)及其前128 bp序列被敲除)大鼠(Tph2~(KO))脑内中缝核5-HT含量;比较10周龄WT和Tph2~(KO)大鼠的体质量;统计旷场试验范式中WT和Tph2~(KO)大鼠进入中心区域的时间、次数,以及高架十字迷宫范式中WT和Tph2~(KO)大鼠进入开放臂和闭合臂的时间、次数,从而判断大鼠的焦虑水平;统计强迫游泳范式中WT和Tph2~(KO)大鼠静止漂浮的时间,评估大鼠的抑郁样行为;统计三室试验范式中WT和Tph2~(KO)大鼠探索陌生同龄同性别大鼠的时间及探索空室的时间,评估大鼠的基础社交水平;统计社交新奇测试范式中WT和Tph2~(KO)大鼠探索陌生大鼠的时间,评估大鼠的社交新奇认知能力。[结果]Tph2~(KO)大鼠大脑中缝核5-HT含量为19.08 nmoL/g,极显著低于WT大鼠大脑中缝核5-HT含量(2 075.00 nmol/g)(P0.05)。高架十字迷宫试验中Tph2~(KO)大鼠探索开放臂的时间为69.89 s,次数为5.40次,与WT大鼠(66.25 s,4.30次)无显著差异(P>0.05)。强迫游泳试验中Tph2~(KO)大鼠静止漂浮的时间(43.92 s)与WT大鼠(27.79 s)无显著差异(P>0.05)。社会互动试验中Tph2~(KO)大鼠社会互动时间为224.00 s,极显著高于探索空室的时间(12.57 s)(P0.05);WT大鼠探索陌生鼠2的时间为124.00 s,极显著高于探索陌生鼠1的时间(69.88 s)(P<0.01)。[结论]Tph2基因敲除导致雄性大鼠大脑中缝核5-HT含量显著降低,体质量和社交新奇认知能力均显著降低。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
白玉 许晓东
【目的】利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选建立苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子lef10点突变载体,为进一步研究AcMNPV lef10的功能提供参考。【方法】 利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选BAC修饰系统对AcMNPV lef10进行点突变,由于lef10和必需基因vp1054有重叠,所以在敲除lef10时只能通过引进点突变使lef10失活,避免影响vp1054的正常表达。首先,构建rpsLAMP筛选盒,然后在野生型AcBacmid中引进点突变,方法是通过2次Red/ET重组:第1次重组在野生型AcBacmid lef10中引进rpsLAMP抗性筛选标记...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
白玉 许晓东
【目的】利用Red/eT系统结合RpsL反向筛选建立苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNpV)晚期表达因子Lef-10点突变载体,为进一步研究AcMNpVLef-10的功能奠定基础。【方法】利用Red/eT系统结合RpsL反向筛选BAc修饰系统对AcMNpV Lef-10进行点突变,由于Lef-10和必需基因Vp1054有重叠,所以在敲除Lef-10时只能通过引进点突变使Lef-10失活,避免影响Vp1054的正常表达。首先,构建RpsL-AMp筛选盒,然后在野生型AcBAcMid中引进点突变(方法是通过2次Red/eT重组:第1次重组在野生型AcBAcMid Lef-10中引进RpsL-AM...
[期刊] 水产学报
[作者]
赵心愉 刘娟 邹曙明
细胞因子信号传导抑制蛋白1(SOCS1)是一种重要的负反馈调节因子,广泛参与调控多种细胞因子介导的信号通路,在免疫系统的调节和生物体的生长发育过程中都发挥着至关重要的作用。本实验以已获得的团头鲂socs1a和socs1b基因为编辑对象,在线分析筛选出合适的靶点合成gRNA(guide RNA),然后对1~2细胞期的团头鲂胚胎进行gRNA和Cas9蛋白的混合注射。通过荧光定量PCR在转录水平鉴定socs1a和socs1b的表达和测序在DNA水平鉴定基因的序列突变,成功建立了多种socs1的突变品系。与同期野生型(WT)相比,SOCS1a~(+/-)和SOCS1b~(+/-)团头鲂生长性能增强、体质量显著增加,同时炎症因子TNF-α和IL-6表达量显著增加,而IL-1β表达无明显变化。注射嗜水气单胞菌后,与野生型不同的是,IL-6和TNF-α在SOCS1a~(+/-)和SOCS1b~(+/-)团头鲂的肝脏中的表达均有持续显著上升。本实验通过CRISPR/Cas9系统成功敲除了团头鲂socs1a和socs1b基因,为进一步探讨socs1基因的作用提供了一定的研究基础。同时,也为以养殖鱼类为对象,合理选用CRISPR/Cas9基因编辑技术提供了依据和借鉴。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘卿 梁运祥 葛向阳
在腊样芽胞杆菌DNF409中,narGHJI基因负责编码呼吸过程中硝酸盐还原酶基因nar的α、β、γ、δ四个亚基。通过基因同源重组的方法,利用一段带有终止序列和Ω环的链霉素抗性片段,取代nar中的部分基因片段,实现硝酸盐还原酶的基因敲除,从而得到专一降解亚硝酸盐的突变体菌株,其硝酸盐还原酶的活性降低了80%。该菌与DNF409共同使用,可解除DNF409单独使用时亚硝酸盐严重积累的现象。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
丁修虎 丁强 王悦 夏淑雯 赵芳 陈坤琳 吴家顺 何南 仲跻峰 王慧利 李惠侠
[目的]β-乳球蛋白是由BLG基因编码的蛋白质,是牛乳中主要的过敏原。本试验旨在使用优化后的CBE单碱基编辑器YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因进行单碱基编辑,同时对两种单碱基编辑器在牛胚胎BLG基因敲除效果进行评价。[方法]在奶牛的BLG基因的第一外显子上设计sgRNA序列,通过胞嘧啶碱基编辑器将BLG基因第21位密码子CAG突变为TAG实现c*.61C>T(p.Q21*)的转变,获得终止密码子,使蛋白质翻译提前终止,达到基因敲除的目的。通过体外转录获得sgRNA和YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max的mRNA,显微注射到奶牛胚胎中。收集囊胚进行胚胎基因组扩增,PCR扩增BLG基因目标序列并进行测序验证编辑效率。根据sgRNA的序列,全基因组选择错配碱基最少的5个潜在脱靶位点进行脱靶检测。[结果]分别检测20枚YE1-BE3-FNLS编辑囊胚和24枚YE1-AncBE4max编辑囊胚,PCR测序,YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因的靶向编辑效率为79.17%(19/24)高于YE1-BE3-FNLS的靶向编辑效率60%(12/20),而前者存在较大的编辑窗口,可对sgRNA序列上的多个胞嘧啶进行编辑(C1-C9),后者具有较小的编辑窗口为C2-C4;另外,YE1-BE3-FNLS具有较高的靶位点双链编辑效率35%(7/20),而YE1-AncBE4max只有2枚编辑胚胎发生双链编辑,纯合编辑率较低;经分析,两种单碱基编辑器制备的编辑胚胎均未出现插入缺失和脱靶效应。[结论]本文使用的两种胞嘧啶碱基编辑器均能高效制备奶牛BLG基因编辑胚胎,为进一步获得BLG基因单碱基敲除奶牛储备技术方法。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
曹必溥 傅雪琳 蔡晓丹 何平
【目的】敲除鱼腥藻PCC 7120的alr0267基因,并对其功能进行初步研究。【方法】克隆获得鱼腥藻PCC 7120 alr0267基因部分片段,通过构建敲除载体,使其与目的基因发生单交换同源重组,从而将鱼腥藻PCC 7120中的alr0267基因敲除,并对敲除体进行纯化和PCr鉴定,然后对alr0267敲除体和野生型固氮异形胞进行形态观察和统计,同时采用实时荧光定量PCr,在培养不同时间(0,3,8,24h和10d)检测野生型和alr0267基因敲除体中与异形胞功能相关基因all0813、all2736、alr2887的相对表达量。【结果】鱼腥藻PCC 7120 alr0267基因被成功敲...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
杨万风 刘红霞 娄旸 胡白石 许志刚 刘凤权
根据黄单胞菌gacA基因的同源性设计简并引物,采用PCR方法从水稻白叶枯病菌(Xanthom onas oryzaepv.oryzae,Xoo)中克隆了gacA同源基因,命名为gacAXoo。序列比较显示,该基因在黄单胞菌中是相对保守的。蛋白质保守结构域搜索表明,GacAXoo属于LuxR家庭的一员,具有与其他GacA蛋白相似的结构。通过同源重组的方法,构建了gacAXoo的插入突变体,为下一步研究gacAXoo的功能奠定了良好的基础。
关键词:
水稻白叶枯病菌 gacA基因 基因敲除
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王丹丹 唐雨婷 马月辉 王立刚 潘登科 蒋琳
【目的】ZBED6基因是一个调控肌肉生长发育的转录因子,为了探讨ZBED6在心肌生长发育中的调控机制,利用RNA Sequencing(RNA-Seq)技术比较ZBED6基因敲除巴马小型猪(ZBED6-KO)和同日龄正常巴马小型猪(ZBED6-WT)的心脏组织转录组,挖掘ZBED6基因的敲除对家猪心脏组织发育及基因表达的影响。【方法】利用t-test对ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织大小的表型特征进行显著性分析,利用实时荧光定量PCR对ZBED6基因的靶基因IGF2的表达量进行定量。通过制作
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
刘晓柱 李银凤 于志海 刘晓辉 黄名正
以菜豆晕疫病菌(Pseudomonas syringae pv.phaseolicola)NPS3121株系为出发材料,根据Gen Bank中登录的1448A甘油激酶(glycerol kinase,GK)氨基酸序列设计同源引物,通过PCR克隆NPS3121 GK基因,序列全长为1 506 bp,可编码1条含501个氨基酸的多肽。生物信息学分析表明,NPS3121 GK包含469个氨基酸,相对分子质量为55 800,富含α–螺旋结构,等电点为5.44。通过整合突变的方式构建了NPS3121 GK敲除突变体,敲除突变体与野生型相比,在M9培养基中生长速率降低18%,在KBM培养基中生长速率降低16%。敲除突变体中甘油浓度较野生型提高了6倍。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
宋娜 戴青青 宋娜 黄丽丽 韩青梅
【目的】利用反向遗传学方法构建苹果树腐烂病菌(Valsa mali)中表达GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1的敲除载体,通过同源重组的方法进行基因敲除分析目标基因的功能,为全面解析苹果树腐烂病菌致病的分子机制奠定基础,并为有效控制苹果树腐烂病的方法技术和药剂研制提供理论依据。【方法】通过对笔者实验室苹果树腐烂病菌转录组数据的分析比对得到GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1(暂命名),该基因在接种5 d后,在病组织中表现出一定的上调表达,推测该基因可能与苹果树腐烂病菌致病相关。采用Double-joint PCR方法,将目标基因Vmgtp1的上游片段UP、下游片段DOWN及筛选标记潮霉素磷...
关键词:
苹果黑腐皮壳 同源重组 PEG 致病性
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李华 鲁慧囡 何璟
以酮基合酶基因KSa的简并性引物对Streptomyces sahachiroi基因组进行扩增,发现除了已知的阿嗪霉素B生物合成基因簇以外,还存在一个潜在的聚酮合酶(PKS)基因sahA。对sahA编码的氨基酸序列进行同源性比对及进化树分析,结果表明,sahA属于Ⅱ型聚酮合酶基因家族,与合成孢子色素的基因亲缘关系较近。通过单交换中断sahA基因后,链霉菌孢子的颜色由铅灰色变为白色,而产孢时间、孢子的产量以及其抗紫外线的能力都没有变化,对抗生素阿嗪霉素B的产量也没有影响。初步证实这个潜在的Ⅱ型聚酮合酶基因sahA很可能与S.sahachiroi孢子色素的生物合成有关。
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