采用单克隆抗体制备技术,建立了分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,液氮保存4年后复苏,细胞在HAT选择培养基中生长旺盛,分泌抗体稳定,分别命名为YNF1,YNF2,YNF3,YNF4,杂交瘤细胞染色体数介于96~115条。细胞培养上清和腹水的单抗间接ELISA效价分别为1∶80~1∶160和1∶5 000~1∶10 000。在间接ELISA和夹心ELISA检测中单抗与猪瘟病毒呈特异性反应,与正常的猪、兔肾组织提取液及其血清Ig无交叉。抗体蛋白属IgG类,亚类及轻链分别为IgG1/λ,IgG2a/κ,IgG2a/λ,IgG1/λ。结果表明,4株杂交瘤是分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的细胞株,可长期...

分泌ＩＨＮＶ－Ｂ病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立赵志壮，牛鲁祺（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨１５００７６）刘长明（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，１５０００１）关键词传染性造血器官坏死症病毒中国本溪株，单克隆抗体，杂交瘤ＥＳＴＡＢＬＩＳ...

为了获得稳定、高效分泌抗软骨藻酸(DA)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用活泼酯法制备软骨藻酸免疫抗原(DA-KLH)和包被抗原(DA-BSA),以DA-KLH免疫BALB/c小鼠,用细胞融合技术筛选抗软骨藻酸单克隆抗体杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备大量单抗,捕获EL ISA法测定小鼠免疫球蛋白亚型,间接ELISA法测定腹水效价;用G蛋白亲和层析法来纯化腹水。结果显示,成功构建2株能稳定分泌DA单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株2B1和4C2,抗体亚类分别为IgG1和IgG2a,间接EL ISA检测小鼠腹水的抗体效价达1∶64 000,腹水纯化后蛋白浓度为1.27和0.675 mg/mL。研究...

以BSA-CAP-HS免疫Balb／C小鼠,用细胞融合技术筛选抗氯霉素单克隆抗体(CAP mAb)杂交瘤细胞,体内诱生腹水法制备cAP mAb,并鉴定其免疫学特性;依据胶体金免疫层析试验(GICA)原理,以CAP mAb 为金标抗体,研制CAP残留快速检测金标试纸(CAP-Strip),并对其性能进行测定。结果表明,筛选出了3株杂交瘤细胞,其中最好的4F9-B2株间接ELISA效价细胞培养上清为1:1 280,腹水为1:640 000,亲和常数(Ku)为 1．84×1010 L/mol,对CAP的半数抑制浓度(IC50)为0．88μg/L,与氯霉素琥珀酸钠的交叉反应(CR%)为150%,与其他...

【目的】制备高灵敏、高特异性的抗春雷霉素单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】采用EDC法将KSM分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫原KSM-BSA和包被原KSM-OVA,经SDS-PAGE鉴定后,免疫Balb/c小鼠,免疫间隔4周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗KSM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗KSM的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】SDS-PAGE鉴定结果显示KSM-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的6...

为对猪瘟病毒(CSFV)建立更加有效的临床检测方法。用纯化的猪瘟兔化弱毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。经ELISA方法筛选和3次亚克隆,最终获得了5株能稳定传代并分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为:C7,C9,G9,G10和4E8,其分泌的单克隆抗体(McAb)为IgG1(G9,4E8)和IgG2a(C7,C9,G10)亚类。经鉴定,5株单抗细胞培养上清效价为1∶1 600~1∶3 200,腹水效价为1∶51 200~1∶102 400。交叉试验及特异性抗原阻断试验表明,所制备的McAb与其他抗原无交叉反应性,均完全针对猪瘟病毒(CSFV)抗原决定...

采用碳二亚胺(EDC)法合成卡那霉素完全抗原,免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得3株能稳定分泌抗卡那霉素单克隆抗体的杂交瘤(5D7、6H8、7G4)。选择其中的5D7株抗体,经ELISA鉴定,细胞上清的效价达103以上,腹水效价达到5×104以上;建立了间接竞争ELISA法,通过优化,其检测限为0.5ng/mL,抗体IC50为3.7ng/mL,与妥布霉素交叉反应率为63.8%,与其他抗生素无交叉。可见ELISA具有快速、敏感、特异、简便等特点,适合于KAN残留的快速检测,具有较高的推广应用价值。

【背景】非洲猪瘟（ASF）于2018年8月在中国首次出现，对养猪业造成了巨大危害，损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF，于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒（ASFV）特异性单克隆抗体，建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30，通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白，以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株；对P30蛋白进行截短表达，利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验（iELISA）鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位；并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证，结果显示构建出重组载体pET-28a-P30，经测序其序列未发生突变；IPTG诱导后，P30重组蛋白主要表达在包涵体中，分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1:1混合免疫小鼠，3次免疫后，小鼠血清效价达到1:102 400，说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆，获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞，Western Blot和间接免疫荧光试验（IFA）检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点；截短表达P30蛋白不同片段，选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应，显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化，成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法，检测了190份临床样品，并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比，两方法阳性符合率为90.91%，总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白，经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株，抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高，敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法，为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。

【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p30蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）并初步分析其所识别的线性抗原表位，为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原，免疫6—8周龄BALB/c雌鼠，每两周免疫1次，共免疫3次，首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫，第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化，3次免疫后1 w断尾采血，间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价，选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫，3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4:1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原，间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，有限稀释法进行克隆纯化，直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞，以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗，进行间接免疫荧光试验（IFA）。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜，分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗，进行Western blotting分析，筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因，其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体，p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体，原核表达部分重叠的截短p30蛋白，最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原，以5株MAbs为一抗，以兔抗鼠HRP-IgG为二抗，通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原，经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示，5株MAbs(8F4、1D3、1H2、6C3和8E11)与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA试验呈阳性；Western blotting结果显示，5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应，与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达，而GST-p30bc仅以包涵体形式表达，以两组截短体融合蛋白为包被抗原，通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合，证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域，即第120—153位氨基酸；MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合，证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域，即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白，制备了5株p30 MAbs，定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA，可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。

【目的】制备鸭瘟病毒（ＤＰＶ）ｇＢ蛋白单克隆抗体，为建立ＤＰＶ快速诊断方法及进一步鉴定ＤＰＶ的抗原表位奠定基础。【方法】克隆ＤＰＶｇＢ基因，构建其表达载体并进行原核表达，纯化ＤＰＶ ｇＢ蛋白，以其作为抗原免疫８周龄ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合，进行间接ＥＬＩＳＡ及亚克隆筛选，并对单抗亚类及抗原性进行鉴定。【结果】ＰｃＲ扩增出９１５ＢＰ的目的基因，成功连接于ＰＥＴ－２８Ａ载体，并转化大肠杆菌ＲｏＳＥＴＴＡ进行诱导表达，获得４株稳定分泌抗ＤＰＶ ｇＢ蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为Ａ８Ｄ７、Ｅ６ｃ３、Ｈ１１Ｆ８、Ｈ６Ｆ６，间接ＥＬＩＳＡ检测其腹水效价分别为１∶１０３、１．．．

制备牛血清白蛋白-链霉素(SM-BSA)免疫Balb／c小鼠,用细胞融合技术制备抗链霉索单克隆抗体(SM mAb)杂交瘤细胞,体内诱生腹水法制备SM mAb。依据竞争ELISA原理,应用SM mAb研制SM快速ELISA检测试剂盒(SM-Kit),并对其灵敏度、准确度、特异性、基质效应性等进行检测。结果表明,SM-Kit标准曲线呈典型的S型,线性检测范围为1～128μg／L,相关系数R2=0．925 1,灵敏度为0．45μg／L,半数抑制浓度(IC50)为7．76μg／L,检测限为1μg／L;奶样、猪尿样的平均添加回收率分别为104．45％和84．1％;SM-Kit与双氢链霉素的交叉反应率(C...

【目的】构建转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的阳性细胞株,通过比较各细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果,筛选对猪瘟病毒增殖有明显抑制作用的细胞株,为抗猪瘟转基因猪的构建提供材料。【方法】研究设计了靶向猪Jiv基因的4个shRNA干扰片段,并构建插入干扰片段的慢病毒(P1、P2、P3、P4)。将慢病毒分别转染PK-15细胞,阳性细胞接种猪瘟病毒后72 h用实时荧光定量PCR检测猪瘟病毒RNA的量,以比较4种干扰细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果。将对猪瘟病毒增殖有较好干扰效果的P2慢病毒干扰载体转染猪胎儿成纤维细胞,获得稳定表达靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的猪胎儿成纤维细胞株,作为抗猪瘟病毒...

为有效防治鸭肝炎,建立特异性强、敏感性高、简便快速的DHV检测方法,对分离的DHV进行纯化,并制备单克隆抗体。鸭胚尿囊液中的DHV经冻融、氯仿反复处理、PEG浓缩和超速离心纯化后,免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术,通过间接ELISA法筛选及多次亚克隆,成功获得8株阳性杂交瘤细胞,分别命名为DHV-1、DHV-6、DHV-7、DHV-8、DHV-9、DHV-10、DHV-11和DHV-12,并制备出腹水。8株单抗腹水经ELISA法检测,DHV-7、DHV-8的效价为1∶2 000;DHV-6、DHV-10的效价为1∶8 000;DHV-1、DHV-9、DHV-11和DHV-12的效价为(1∶3...

【目的】制备猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Cap蛋白单克隆抗体,并对其进行鉴定和应用。【方法】以超离纯化的猪圆环病毒Ⅱ型作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,经间接ELISA筛选获得了2株分泌PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为8-60和10-48,对其生物学特性进行鉴定,并将其作为一抗,建立了间接免疫荧光诊断方法。【结果】8-60和10-48的染色体数平均为98～105对,间接ELISA检测其细胞培养上清液效价分别为1∶16和1∶32,小鼠腹水效价分别为1∶3×212和1∶3×213,抗体的免疫球蛋白亚型均为IgM。间接免疫荧光结...

以纯化的牛冠状病毒(BCv)免疫 BALB/c 小鼠,取其脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0融合,用间接 ELISA 筛选,获得了4株分泌 BCV 特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞:C_(12)、C_(31)、C_(42)和C_(54).它们系针对 BCV 不同表面抗原决定簇的.用 C_(12)和 C_(31)两株细胞制备的腹水混合包被聚苯乙烯微孔板,建立了以生物素标记的兔抗 BCV IgG 和酶标亲和素介导的 BAS—ELISA,并对 BCV 标准毒株和临床犊牛腹泻粪样作了检测.