为了解非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)分子伴侣蛋白Hfq在LM毒力中发挥的调控作用,在构建LM-Δhfq缺失株的基础上,通过动物攻毒试验检测野毒株LM-SB5与缺失株LM-Δhfq对昆明系小鼠的LD50,肝、脾载菌量及对肝、脾、肾的病理损伤;通过溶血试验检测二者的溶血活性;通过结晶紫染色的方法检测二者的生物被膜生成能力。以分析hfq基因缺失对LM毒力及生物被膜生成的影响。结果显示,与LM-SB5相比,LM-Δhfq对小鼠的LD50升高了6.067倍,毒力显著降低;肝、脾载菌量在第2

为克隆、表达单核细胞增生李斯特菌sRNA分子伴侣蛋白hfq基因,并纯化重组蛋白,通过PCR的方法从单核细胞增生李斯特菌基因组DNA中扩增出hfq基因,将扩增产物克隆于pMD18-T载体中,测序验证后,再将hfq基因亚克隆至表达载体pET-32a(+)中,成功构建pET-32a(+)-hfq原核表达载体。然后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,通过IPTG进行诱导表达,对表达蛋白进行可溶性分析,并采用Ni-NTA纯化目的蛋白。结果显示:克隆的hfq基因全长234 bp,编码77个氨基酸,通过SDS-PAGE可以检测到27 kDa的蛋白特异性条带;并从上清中纯化得到了Hfq融合蛋白。为...

【目的】探究单核细胞增生性李斯特氏菌Listeria monocytogenes tatD基因缺失对小鼠Mus musculus毒力和肠道菌群的影响，为tatD在单核细胞增生性李斯特氏菌与宿主互作中的作用及减毒疫苗研究提供参考。【方法】采用Bliss法将亲本菌株(LM10403s)、缺失菌株(LM10403sΔtatD)和互补菌株(LM10403sCΔtatD)口服感染小鼠，确定菌株对小鼠的半数致死量(LD50)。LM10403sΔtatD以1.00×105 CFU口服免疫小鼠观察其免疫保护效果。将40只6周龄雌鼠随机平均分为对照即磷酸缓冲盐溶液组(PBS)、LM10403s组、LM10403sΔtatD组和LM10403sCΔtatD组，PBS组小鼠灌胃200μL无菌PBS，实验组分别灌胃200μL含1.00×106 CFU的菌液。灌胃24 h后剖杀各组小鼠，收集肠道内容物，采用Illumina Hiseq测序技术测定各处理小鼠盲肠样品微生物16S rRNA V3～V4区序列，并比较分析其微生物群落结构、多样性和信号通路富集。【结果】LM10403sΔtatD的LD50为8.11×107 CFU，毒力低于LM10403s。同时LM10403sΔtatD口服免疫小鼠后对单核细胞增生性李斯特氏菌亲本菌株的攻毒能提供80%保护率。Chao1和Observed species指数显示：PBS与LM10403sΔtatD处理组差异不显著，但LM10403s组和LM10403sCΔtatD处理组相比于PBS处理组显著下降(P<0.05)。在门水平上，LM10403sΔtatD处理组的厚壁菌门Firmicutes相对丰度高于LM10403s和LM10403sCΔtatD处理组，而在属水平上，乳杆菌属Lactobacillus相对丰度高于LM10403s和LM10403sCΔtatD处理组。功能预测分析显示：LM10403s处理组在细胞过程、环境信息处理和新陈代谢等信号通路的富集程度高于LM10403sΔtatD处理组。【结论】tatD基因缺失后单核细胞增生性李斯特氏菌的毒力降低，并具有一定的免疫保护效果。tatD基因缺失菌株感染小鼠对肠道菌群失调影响减小，且有益菌增多。图6表1参21

为探究单核细胞增生性李斯特菌(LM)毒力岛4(LIPI-4)中膜透性酶(EII)对LM毒力基因表达的调控作用，本研究分别构建EII缺失株(LM928ΔEII)、强启动子回补株(CLM928ΔEII-P_(help))和天然启动子回补株(CLM928ΔEII-P_(native)),测定各菌株在体外培养中的生长曲线和在永生化人脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)内的增殖情况；RT-qPCR检测体外培养和HCMEC/D3细胞内各菌株9个关键毒力基因的转录水平。结果显示：1)EII基因缺失株LM928ΔEII构建成功，重组回补质粒pIMK2-EII和pIMK2-EII-P_(native)及回补株CLM928ΔEII-P_(help)和CLM928ΔEII-P_(native)构建成功。2)在体外培养下，EII对LM的生长曲线没有影响。但在侵染HCMEC/D3后，LM928ΔEII在8和12 h的胞内细菌量显著高于LM928(P0.05),而CLM928ΔEII-P_(help)在2、4、6、8、10和12 h均极显著低于野生株(P

【目的】研究超高压作用对单核细胞增生李斯特氏菌(LM 54004)细胞膜、氧化磷酸化和F0F1-ATP酶的影响。【方法】用原子吸收法测定LM 54004经超高压作用后细胞内金属离子(K+、Mg2+)的泄漏;以亲脂性阳离子四苯基溴化膦([3H]-TPP+)作为放射性探针标记LM 54004细胞膜,测定经超高压作用后细胞膜电位的变化;用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cFSE)为荧光探针测定经超高压作用后细胞内pH的变化;用比色法测定超高压对LM 54004 F0F1-ATP酶活性的影响。【结果】150—300 MPa作用10 min,随着压力的增大LM 54004菌落数显著降低,细胞内K+和Mg2+没有...

为探究单核细胞增生李斯特菌噬菌体裂解酶的特性及在食品基质中的初步应用，从NCBI获取李斯特菌噬菌体裂解酶lys039基因序列，分析其生物信息学，并在大肠杆菌中表达纯化，研究其裂解活性、对生物被膜的影响以及在牛奶基质中的应用。结果表明：1）裂解酶Lys039由341个氨基酸组成，分子质量为36.4 ku，等电点为9.81，其结构具有酰胺酶活性，对本实验室22株单核细胞增生李斯特菌、2株无害李斯特菌、1株伊氏李斯特菌以及1株威氏李斯特菌具有裂解活性，但是对葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及沙门菌没有显示出裂解活性。2）随着Lys039浓度的升高，裂解活性逐渐增强，最适温度为30℃，最适pH值为6.0。3)Lys039能显著清除单核细胞增生李斯特菌形成的生物被膜，并且可以降低牛奶中单核细胞增生李斯特菌的细菌数量。综上，Lys039温度耐受范围广、耐酸耐碱且裂解谱较宽，可显著清除生物被膜以及初步应用效果良好。本研究为进一步防治及快速检测单核细胞增生李斯特菌提供理论基础。

单核细胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes是一种重要的食源性人畜共患病原菌,能引起人和多种动物流产、脑膜炎、肠胃炎、败血症、死胎等病症。与传统基于表型的分型方法相比,基因分型方法具有简单快速、分辨率高、敏感性强、重复性好等特点,在李斯特菌病病原菌的监测和溯源中具有重要的应用价值。对单核细胞增生性李斯特菌的3类基因分型方法:酶切技术,DNA测序技术和聚合酶链式反应(PCR)扩增技术进行了概述,从分型成本、样本通量、分辨力、灵敏度、重复性、快捷性和普及性等方面比较了3类基因分型方法的主要特点,重点评述了这些方法在单核细胞增生性李斯特菌暴发监测和溯源上的应用案例,为研究不同基因分型方法在单核细胞增生性李斯特菌暴发诊断、分型检测及感染溯源等方面的应用提供参考。

【目的】构建绵羊肺炎支原体(MO)p74基因重组单核细胞增生李斯特菌(LM)并分析其免疫原性,为研发MO重组活疫苗奠定基础。【方法】采用PCR方法从LM-SB5株基因组中扩增出rli60基因的上、下游同源片段a和b,从质粒pET-32a(+)-p74中扩增出MOp74目的基因片段,利用重叠延伸PCR方法(SOE-PCR)将扩增的3个片段融合成ap74b基因片段,克隆入pMD19-T载体中进行测序鉴定。将ap74b片段从pMD19-T载体上切下亚克隆入pKSV7穿梭载体,构建pKSV7-ap74b重组穿梭质

【目的】通过对检测食源性致病菌单核细胞增生性李斯特氏菌(LM)的多重PCR体系的优化,建立一种能够在食品样品中应用的四重PCR。【方法】采用热裂解提取菌液和菌落DNA,以16SrRNA、inlAB、iap、hly基因为靶基因设计引物,从影响多重PCR扩增的引物浓度、退火温度进行优化。【结果】通过其它5种同属异种菌即英诺克李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、威尔西李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌及副溶血性弧菌均未扩增出特异性的片段。纯培养物的最低检测限为102CFU/mL,模拟污染的生猪肉检测限不大于0.4CFU/g。【结论】通过菌落获得DNA的多重PCR方法更好,该方法具有敏感、特异、快速及...

[目的]本文旨在研究绿色魏斯氏菌与单增李斯特菌共存对单增李斯特菌的生长能力、毒力基因表达及细胞黏附能力的影响,揭示乳酸菌与单增李斯特菌之间的交互作用机制。[方法]采用膜隔离装置,取4℃贮藏条件下放置0、12、24、48和96 h的菌悬液分别测定单增李斯特菌和绿色魏斯氏菌的数量,同时提取单增李斯特菌的RNA进行反转录和荧光定量PCR,分析单增李斯特菌6种主要毒力基因(hly A、prf A、bsh、act A、sig B和inl A)的表达情况。利用Caco-2细胞进行绿色魏斯氏菌与单增李斯特菌的竞争、排斥和置换试验,观察单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附效果。[结果]产细菌素绿色魏斯氏菌C1可降低单增李斯特菌的数量,而不产细菌素绿色魏斯氏菌C2对单增李斯特菌的生长影响不大。C1和C2的代谢产物使单增李斯特菌6种毒力基因表达量下调,且C1导致的下调趋势比C2大。C1主要通过置换和竞争作用来抑制单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附,而C2的作用较弱。[结论]产细菌素绿色魏斯氏菌C1比不产细菌素绿色魏斯氏菌C2能够更好地控制单增李斯特菌的生长,抑制相关毒力基因的表达,并主要通过置换和竞争作用来抑制单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附。产细菌素绿色魏斯氏菌C1可作为单增李斯特菌的防控菌株。

为探究超高压处理对单增李斯特菌被膜形成能力的影响。以2株4b血清型的单增李斯特菌(Wa X12、ATCC13932)为研究对象进行超高压处理(100500 MPa,15 min,20℃),通过24孔板结晶紫染色方法对2株菌生物被膜形成能力进行检测,结合荧光显微镜和扫描电镜来观察生物被膜形成情况。Wa X12比ATCC13932形成被膜的能力强。100 MPa压力处理显著增强Wa X12的被膜形成能力(P

本研究比较分析了不同温度（４、１５、２５和３７℃）、ｐＨ（４、５、６和７）及ＮａＣｌ浓度（０．５％、２．５％、４．５％和６．５％）对单增李斯特菌野生型菌株（ＷａＸ１２）及ｓｉｇＢ缺失突变型菌株（ＷａＸ１２－ΔｓｉｇＢ）生物被膜形成能力的影响。结果表明，相比于ＷａＸ１２菌株，ＷａＸ１２－ΔｓｉｇＢ菌株生物被膜的形成量显著降低（ｐ＜０．０５）。变异系数分析显示，不同培养条件对ＷａＸ１２菌株及ＷａＸ１２－ΔｓｉｇＢ菌株生物被膜形成能力均有影响，其中温度的影响最大，ＮａＣｌ浓度次之，ｐＨ最弱；且ＷａＸ１２－ΔｓｉｇＢ菌株生物被膜形成能力更易受到培养条件的影响。其次，分别选取了ＷａＸ１２菌株与ＷａＸ１２．．．

为了解RybB sRNA、RNA伴侣蛋白Hfq对沙门菌外膜蛋白fadL、ybfM、ompN的作用，利用λ-red同源重组系统构建fadL、ybfM、ompN基因lac融合菌株，通过P22噬菌体转导完成颜色指示菌株中RybB、hfq基因的单缺失与双缺失，进行β-半乳糖苷酶活性试验和qPCR,对其相应表达量进行分析.结果表明，Hfq抑制ybfM、ompN的表达，但fadL的表达上调；RybB sRNA抑制ompN、fadL的表达，但ybfM的表达上调.当Hfq与RybB共同对ybfM、fadL、ompN进行调控时，对ompN、ybfM的表达具有抑制作用，但fadL的表达上调，且Hfq的调控作用总体大于RybB.

急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease， AHPND)严重影响了我国乃至全球对虾养殖业的发展。近期研究发现，致病菌毒力质粒携带trb型Ⅳ型分泌系统(Type Ⅳ secretion system， T4SS)，可在高菌体密度下介导毒力质粒发生接合转移，从而导致AHPND致病菌多样性。为探究群体感应与T4SS表达以及毒力质粒接合转移的关系，本研究以副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)群体感应系统的高密度调控子OpaR为研究对象，在致AHPND副溶血弧菌20130629002S01::cat(Vp2S01::cat)菌株基础上，利用同源重组技术构建opaR基因缺失株Vp2S01::catΔopaR。比较了出发菌株和缺失株在生长性能、运动性和生物被膜形成能力等方面的差异，分析了opaR基因对T4SS基因表达量以及质粒接合转移效率的影响。结果显示，opaR基因缺失不影响细菌的生长特性和群集运动，但泳动能力显著增加，生物被膜形成能力显著下降；接合转移实验显示，opaR基因缺失显著提高T4SS表达水平和接合转移效率。本研究为解析群体感应系统调控AHPND致病菌T4SS表达以及毒力质粒接合转移机制提供了基础数据，可为控制AHPND致病菌毒力质粒传播提供技术支撑。

细菌的Ⅲ型分泌系统(T3SS)与毒力密切相关。为探究鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和伴侣蛋白Hfq对T3SS相关基因spaP、invC、invG、prgH、prgI、prgJ、prgK的调控，利用Red同源重组技术构建了上述基因与lacZ的融合菌株，在此基础上利用P22噬菌体转导技术分别构建上述融合菌株与gcvB、hfq的单缺失菌株，通过qPCR和β-半乳糖苷酶试验分别检测gcvB、hfq缺失后各基因的转录水平和蛋白水平的变化。结果显示：与标准菌株相比，gcvB缺失后，spaP、invC、prgH、prgI、invG的转录水平和蛋白水平均上调；prgJ、prgK的转录水平上调，蛋白水平下调。hfq缺失后，spaP、invC、prgH、prgI、invG的转录水平和蛋白水平均上调，prgH、prgI、prgJ、prgK的蛋白水平下调。表明Hfq和GcvB均可对spaP、invC、invG、prgH、prgI、prgJ、prgK进行调控。上述结果可为鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和Hfq的作用机理研究提供参考。