6-磷酸海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase, TPS)是海藻糖合成的关键酶,在生物体逆境胁迫应答中发挥着重要的作用。本研究以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)高温胁迫转录组测序的Unigene序列为基础,采用直接PCR扩增的方法,获得了TPS部分c DNA(完整的ORF和部分UTR)序列(LvTPS)。序列分析结果显示,LvTPS序列包含1个2529 bp的开放阅读框,可编码842个氨基酸,分子量为95.4kDa,等电点为6.17。LvTPS具有Glyco-transf-20和TrehalosePPase2个功能结构域。多序列比对结果显示,LvTPS与中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)的相似性最高,为63.73%;系统进化树显示,凡纳滨对虾与中国对虾亲缘关系最近,并与蓝蟹(Callinectes sapidus)、脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)等无脊椎动物聚为一支,脊椎动物单独聚为一支。基因表达水平的定量分析结果显示,LvTPS在鳃、肝胰腺、眼柄、心脏、神经和肌肉6种组织中均表达。鳃和肌肉表达量基本相同,为最高;眼柄、心脏和神经表达量次之,显著低于鳃和肌肉中的表达量(P<0.05);肝胰腺中表达量为最低,显著低于其他5种组织中的表达量(P<0.05)。与26℃温度下的凡纳滨对虾相比,水温升至32℃时,眼柄和心脏中的LvTPS显著上调表达(P<0.05);水温升至38℃时,鳃、肝胰腺、眼柄和心脏中LvTPS显著上调表达(P<0.05)。其中,在肝胰腺中表达量变化较显著。之后,随着温度的下降,其表达量总体呈下调趋势。回温至32℃和26℃时,6种组织中LvTPS基因表达量与对照组均无显著性差异。在神经和肌肉中,不同温度胁迫下的LvTPS基因表达量没有显著变化。上述研究结果表明,LvTPS与凡纳滨对虾应对高温胁迫过程密切相关。本研究可为解析凡纳滨对虾应答高温胁迫机制提供一些基础数据。

6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)是植物海藻糖合成的关键酶,在植物逆境胁迫应答中发挥着重要的作用。实验以坛紫菜转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE技术克隆获得坛紫菜的3条TPS基因序列:Ph TPS1,Ph TPS2-1和Ph TPS2-2。序列分析结果表明,Ph TPS1(收录号:KM580358)序列全长3 557 bp,包含一个3 462 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含1 153个氨基酸,分子量为124.2 ku,等电点为6.73,属于TPSⅠ亚家族;Ph TPS2-1(收录号:KM519457)序列全长4 264 bp,包含一个4 044 bp的开放阅读框,所编码的多...

为了获得一个优良的玉米抗旱育种基因资源,借助于生物信息学手段和分子生物学实验操作技术,从木棉植物中获得了一个编码海藻糖-6-磷酸合成酶的抗旱基因序列。根据玉米对密码子使用的偏爱性,合成了1个可用于玉米转化并提高其耐旱性的新的海藻糖-6-磷酸合成酶基因,进一步通过DNA分子的酶切和连接等操作将该基因构建成表达质粒,再导入大肠杆菌和酵母细胞以鉴定其是否能在原核和真核细胞中表达。最后该基因被构建到植物表达载体上,并转入农杆菌细胞。结果表明,新合成基因全长为2 586 bp,包含完整的开放阅读框,编码861个氨基酸;构建出的原核和真核表达质粒与预期的结果相符,该基因可用于细胞转化试验;该新合成基因能在大肠杆菌和酵母细胞中有效表达出海藻糖-6-磷酸合成酶;该基因被成功构建到植物表达载体p CAMBIA-2300上,并转入了农杆菌细胞LBA4404工程菌株。综合上述结果认为,获得了1个新的海藻糖-6-磷酸合成酶基因,该基因能在原核和真核细胞中有效表达出海藻糖-6-磷酸合成酶,构建的植物基因表达质粒可以直接用于玉米抗旱转基因育种。

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)具有较强的环境适应能力，对盐碱水环境有一定的耐受性，但在高pH、高碱环境下的存活率不稳定。为探究凡纳滨对虾对长期高碱胁迫的响应机制，本研究以低碱对照组(LSW：碳酸盐碱度为3 mmol/L，盐度为6,pH为8.1)和高碱胁迫组(AW：碳酸盐碱度为10 mmol/L，盐度为6,pH为8.8)养殖42 d的凡纳滨对虾肠道和鳃组织作为实验材料，通过Illumina平台进行转录组测序，对测序数据进行拼接、注释，进而筛选、分析高碱胁迫下的差异表达基因及调控通路并进行定量PCR验证。结果显示，2个组织共同差异表达基因有243个，其中，98个表达上调，145个表达下调。肠道中差异表达基因主要集中在糖代谢、碳水化合物消化吸收、胆汁分泌、ABC跨膜转运、紧密连接以及免疫调节等途径。鳃中差异表达基因主要集中在谷胱甘肽代谢、碳酸氢盐转运、精氨酸合成、糖代谢以及离子转运等相关途径。进一步筛选获得10个最显著的差异表达基因，经qRT-PCR验证发现，凡纳滨对虾鳃中碳酸酐酶(CA1、CA10)、蜕皮激素诱导蛋白(Eip74EF)、β-半乳糖基转移酶(UGT8)基因在高碱胁迫下均表达下调，而Na~+/K~+ -ATPase-α(NKA-α)、Na~+/K~+ transporting ATPase interacting (NKAIN)、氨转运蛋白(Rhbg)、苹果酸脱氢酶(MDH)等基因表达上调，与转录组表达趋势一致，推测其可能参与了对虾高碱胁迫下的应激响应。凡纳滨对虾表现出较强的高碱适应性，可能是通过下调鳃中CA的表达，补偿体内碱中毒，上调Rh氨转运蛋白防止氨在体内积累，上调NKA相关基因维持体内渗透平衡；但蜕皮激素诱导蛋白(Eip74EF)显著下调，推测其蜕皮功能受到影响。本研究为深入探讨凡纳滨对虾在长期高碱胁迫条件下的生理响应机制提供了基础数据。

为了探讨海藻糖在大型藻类抗逆中的作用及其机制，实验利用生理生化分析、高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)、荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析了外源海藻糖对高温胁迫下大型海藻龙须菜生长、抗逆相关物质和酶活性、植物激素及相关基因表达的影响。结果发现，外源添加10 mmol/L海藻糖使龙须菜的相对生长速率和脯氨酸含量分别升高0.34倍(3 d)和0.30倍(24 h)，叶绿素荧光参数、超氧化物歧化酶和海藻糖-6-磷酸合成酶活性升高，但丙二醛含量和脂氧合酶(LOX)活性降低。同时，海藻糖激活了龙须菜中水杨酸代谢关键酶—异分支酸合成酶的活性及其基因表达，促进了水杨酸的积累(2.05倍)。此外，海藻糖可以使热激蛋白70基因表达稳定升高、lox2基因表达下调(12 h)。可见，外源海藻糖可以通过清除活性氧自由基，降低膜脂过氧化，促进渗透保护物质和抗逆植物激素水杨酸的积累等来促进高温下龙须菜的生长。该研究证明了海藻糖在龙须菜抗高温胁迫中具有重要作用，为龙须菜的抗逆育种工作提供了参考。

根据本实验室构建的斑节对虾（Ｐｅｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｄｏｎ）ｃ ｄｎａ文库得到的ｅｓＴ序列，利用Ｒａｃｅ技术获得了斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因（Ｐｍ Ｇｓ）的ｃ ｄｎａ全长序列，进行了相关生物信息学分析，在此基础上采用荧光定量的方法研究了Ｐｍ Ｇｓ基因在斑节对虾不同组织、氨氮胁迫过程中差异表达情况。该序列全长１ ４２０ｂＰ，开放阅读框（ｏＲＦ）为１ ０８６ ｂＰ，３＇非编码区（ｕＴＲ）为２９４ ｂＰ，包括含有２７个碱基的Ｐｏｌｙ（ａ）尾，５＇非编码区（ｕＴＲ）为４０ ｂＰ。ｏＲＦ可编码３６１个氨基酸，预测分子量为４０．４２３ ｋｕ，理论等电点为６．１９。序列含有一个谷氨酰胺结合结构域（Ｇｌｎ－ｓ．．．

以广盐性养殖的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,采用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)和定量PCR的方法,研究其在高碳酸盐碱度胁迫下转录组水平的基因表达差异,以期从基因组水平研究对虾对高碳酸盐碱度胁迫的适应机制。结果表明,以高碳酸盐碱度(20 mmol/L)胁迫第4天凡纳滨对虾鳃组织和低碱度(2 mmol/L)对照组鳃组织为材料,通过斑点杂交筛选,发现鳃组织中有158个克隆子表达上调,291个克隆子表达下调。挑选150个高表达差异的克隆子进行测序,获得100个序列,其中50个得到成功注释。经过GO分...

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)是中国主要的对虾养殖品种之一,对低温的耐受性较差,低于18℃就会停止摄食。为了探究凡纳滨对虾耐低温性状相关基因,选用凡纳滨对虾低温胁迫组(18℃)和常温组(24℃)肝胰腺组织为实验材料,进行Illumina HiSeq 2500测序,对测序原始数据进行拼接、注释,以及筛选分析低温胁迫下的差异表达基因。结果显示,测序共获得50921条基因(unigene),平均长度为828 bp, N50为1589 bp,其中28.13%为已知基因。基因差异表达分析共筛选得到243个低温胁迫相关基因,其中89个上调表达, 154个下调表达。功能富集分析发现,差异表达基因多富集在生物结合和催化过程、过氧化物酶、溶酶体、精氨酸和脯氨酸的代谢以及氨基酸的生物合成途径中。进一步根据Q-值共筛选出10个差异表达最显著的基因,其中ATP结合盒B亚家族6转运蛋白基因(ATP-binding cassette sub-family B member 6, ABCB6)、C型凝集素基因(C type lectin)、谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase, GS)在低温胁迫下均呈下调表达,推测可能参与了凡纳滨对虾低温应答反应。利用Real time RT-PCR验证转录组数据,结果证明基于转录组测序筛选低温胁迫下的差异表达基因是可行的。本研究为揭示凡纳滨对虾耐低温分子调控机制提供了基础数据和理论依据。

为研究亚硝态氮慢性胁迫对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)(2.03±0.33 g)生长、摄食、体成分和糖代谢的影响，实验设置0 (对照组)、8 mg/L (N8组)、15 mg/L (N15组)和30 mg/L NO_(2)~(–)-N (N30组)亚硝态氮浓度组，进行36 d的亚硝态氮慢性胁迫实验。结果显示，随着亚硝态氮浓度升高，对虾的终末体重、特定生长率、增重率和日摄食率均呈显著下降。N8组和N15组对虾的血糖和肝胰腺中糖原含量在实验中期高于对照组，但最终均低于对照组，而肌肉中糖原含量在实验期间始终低于对照组。胁迫组对虾肌肉中的己糖激酶活力低于对照组；而肝胰腺己糖激酶活力和丙酮酸激酶活力均高于对照组，同时，肝胰腺乳酸含量与乳酸脱氢酶活力先上升后下降，最终与对照组无显著性差异。终末体成分中，N30组的粗脂肪含量显著低于对照组。结果表明，亚硝态氮慢性胁迫会降低对虾食欲，减缓对虾的生长，机体糖代谢调节可作为对虾应对亚硝态氮慢性胁迫的短期响应，对虾对脂质的利用在应对亚硝态氮慢性胁迫过程中起重要作用。

为了探讨凡纳滨对虾转录因子AP-1在病毒引发的免疫应答过程中的潜在作用,实验根据前期的转录组和表达谱结果提示信息,首次克隆了凡纳滨对虾AP-1基因(LvAP-1,GenBank注册号:KF999956),利用在线软件进行了生物信息学分析,运用半定量的方法进行了组织表达分析,并利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了该基因在白斑杆状病毒(WSSV)侵染过程中的表达变化特征。结果显示,AP-1基因ORF区全长882 bp,编码293个氨基酸。预测分析显示该基因编码的蛋白质含有1个Jun结构域和1个高度保守的亮氨酸拉链结构域(bZIP),其中Jun结构域在非脊椎动物中保守性不高。组织表达分析表明...

通过搜索凡纳滨对虾EST数据库,获得3个包含完整开放阅读框的sHSP cDNA序列。对3个sHSP cDNA和相应蛋白序列进行多序列比对发现,3个sHSP的cDNA序列同源性非常高,均达到95%以上,但在开放阅读框第376 bp之后,3个基因间有多个插入和缺失突变,使编码的蛋白序列在C端有较大差异,sHSP-1与sHSP-2、sHSP-3蛋白的同源性只有86.5%和78.7%。不同物种多个sHSP蛋白序列构建的系统进化树显示,3个sHSP与其他物种的HSP20.6、HSP21.4和HSP Beta亲缘关系都很近,推测不同物种sHSP起源相似,且同一物种的不同sHSP通过基因复制产生。运用荧光定...

果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(fructose-1,6-diphosphate aldolase,FBA,EC4.1.2.13),简称醛缩酶,是糖酵解代谢途径中第4步关键酶,催化果糖-1,6-二磷酸(Fru-1,6-BP)可逆地裂解为磷酸二羟丙酮(DHAP)和3-磷酸甘油醛(G-3-P)(Rutter,1964)。其中,DHAP经甘油磷酸脱氢酶的催化,还原生成3-磷酸甘油,然后在脂酰转移酶的作用下生成磷脂酸,再经磷脂酸磷酸酶水解,形成油脂合成

研究不同程度低温胁迫条件下凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)主要消化酶活性的变化规律,以期为低温消化生理学及低温条件下投喂饵料成分配比的调整提供参考。试验设计20、16℃两个温度组,每组设计5个取样时间点,每组以28℃(常温)为对照组。对各组取样实验虾的肝胰腺及胃肠进行胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶3种消化酶活性的测定。结果表明,3种消化酶在不同温度下的活性顺序均为28℃>20℃>16℃;3种消化酶活性顺序为胰蛋白酶>淀粉酶>胃蛋白酶。淀粉酶及胃蛋白酶的活性顺序为肝胰腺>胃肠,胰蛋白酶活性顺序为胃

以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,探讨饲料中添加聚β-羟基丁酸酯(Poly-β-hydroxybutyrate,PHB)对其非特异性免疫能力的影响。采用单因子浓度梯度法,在基础饲料中分别添加1.0%、2.5%和5.0%的PHB配制成实验饲料,饲喂21 d后测定对虾免疫酶活性,选择最佳浓度组与空白对照组进行氨氮胁迫实验,测定对虾丙二醛(MDA)含量,同时利用RT-PCR技术测定氨氮胁迫48 h内对虾免疫基因表达水平,观察PHB对免疫基因表达量的影响。结果显示,总抗氧化能力(T-AOC)随PHB浓度升高呈现先上升后下降的趋势,血液、肝胰腺及鳃丝中T-AOC分别在2...

为探究饲料中胆固醇含量对淡水养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)免疫相关基因表达及耐低温低溶解氧胁迫能力的影响,在鱼粉含量为10%的基础饲料中分别添加0、1.0、2.0、3.0、4.0 g/kg的胆固醇,制成5组等氮等能饲料(C0、C1、C2、C3和C4,实测胆固醇含量依次为0.78、1.57、2.45、3.43和4.18 mg/g)投喂初始体质量为(0.14±0.03) g的凡纳滨对虾。养殖8周后检测对虾耐低温和低溶解氧胁迫的能力以及急性感染副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)后免疫相关基因(Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA)相对表达量。结果表明:饲料胆固醇含量显著影响弧菌急性感染后对虾鳃组织Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA相对表达量。在弧菌感染进程中,C2组对虾Toll受体和溶菌酶的mRNA表达量表现出最大的变化幅度;而IMD mRNA表达量最大变化幅度出现在C1组,其次为C2组。急性感染弧菌后各组对虾Toll受体和溶菌酶mRNA相对表达量峰值均出现在感染后24 h;C2、C3和C4组IMD mRNA表达量峰值出现在感染后24 h,而C0和C1组IMD mRNA表达量峰值出现在感染后42 h。急性程序降温胁迫下,C0和C4组对虾100%死亡的温度为15℃;而其他组对虾100%死亡的温度为14℃。急性低溶解氧胁迫下各组对虾的耗氧量和致死溶氧浓度无显著性差异。综上所述:在淡水养殖条件下,饲料中2.45 mg/g的胆固醇含量可以提高凡纳滨对虾的免疫灵敏性,而饲料中胆固醇含量为(1.57～3.43) mg/g时凡纳滨对虾表现出较好的抗低温胁迫能力。