对虾传染性皮下及造血组织坏死病(IHHN)为对虾主要病毒病之一,近些年,在全球范围内广泛流行并造成严重的经济损失。目前,在流行病学和诊断方面受到重视,但其致病机理鲜有报道。本研究首先构建了IHHNV CP原核表达载体,纯化CP蛋白并制备多抗,抗体效价达到1︰51200;利用匀浆、超速离心方法分离未感染IHHNV的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃细胞膜蛋白;用VOPBA和HIS PULL–DOWN方法筛选凡纳滨对虾鳃细胞膜IHHNV CP受体,分别将疑似的蛋白条带进行LC-MS/MS分析。结果表明,信号转导与转录激活因子(STAT)、热休克蛋白90(HSP 90)、酚氧化...

本研究对白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)与传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus,IHHNV)能否竞争虾鳃细胞膜上的NM23蛋白受体进行探索。先用蔗糖梯度离心法提纯WSSV的全蛋白,利用病毒覆盖蛋白印迹技术(VOPBA)与对虾鳃细胞膜NM23蛋白作用,将疑似蛋白条带进行LC-MS/MS分析,初步筛选出3种WSSV蛋白,分别为WSSV013、Wsv497和Wsv

为了探究LvRab5B蛋白在凡纳滨对虾抗病毒感染中的作用,实验分别构建了LvRab5B蛋白在昆虫和酵母细胞中的融合表达载体,将不同的载体导入不同的细胞中,利用免疫荧光和酵母双杂交的方法研究了Lv Rab5B蛋白在昆虫细胞中的表达以及Lv Rab5B蛋白与病毒IHHNV之间的互作关系;通过qRT-PCR方法研究了该蛋白在健康对虾不同组织中的表达情况以及凡纳滨对虾分别感染IHHNV和WSSV后不同时间点的相对表达量。结果显示,Lv Rab5B基因融合蛋白能够在昆虫细胞中表达;Lv Rab5B蛋白与IHHNV病毒衣壳蛋白CP无相互作用,而与非结构蛋白NS1相互作用明显,与非结构蛋白NS2作用较弱。qRT-PCR结果显示,LvRab5B基因在凡纳滨对虾心脏、鳃腺、肠道、胃、肝胰脏和肌肉中都表达,在肠道中表达量最高,肝胰脏次之;Lv Rab5B蛋白在凡纳滨对虾机体感染病毒前后的表达情况不同,感染初期表达降低,随后迅速上升,末期下降。研究表明,LvRab5B基因参与凡纳滨对虾抵抗IHHNV和WSSV病毒的先天免疫过程,为进一步研究Lv Rab5B蛋白在对虾机体中的免疫功能及作用机制奠定了基础。

将VP110基因的部分序列克隆到pET-28a载体中构建pET28a-vp110b重组质粒并进行原核表达,获得重组表达的蛋白rVP110-B;用rVP110-B注射凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei后,经WSSV感染,实验表明,该蛋白注射使凡纳滨对虾感染WSSV的半数死亡时间比对照组延长了20%。用表达纯化的该重组蛋白制备了兔抗rVP110-B多克隆抗体,该抗体用于凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白与rVP110-B的Far-western分析显示,凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白中除90 kDa左右的血蓝蛋白外,在41.7 kDa存在结合条带,经质谱分析表明这条鳃细胞膜蛋白是肌动蛋白。

采用亲和层析、SDS-PAGE、Far-Western-blotting、MALDI-TOF/MS等亲和蛋白质组学方法,发现凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血蓝蛋白可与人红细胞膜上一种分子量为27 kD的膜蛋白发生特异性结合,经Mascot搜索引擎检索该蛋白与人红细胞膜蛋白——硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase)具有高度同源性。继而运用生物信息学技术对其相互作用进行分析,结果显示,硫氧还蛋白过氧化物酶与血蓝蛋白在三维结构水平可发生特异性的对接,且其结合位点呈现"锁钥模型"。由此推测,硫氧还蛋白过氧化物酶可能为对虾血蓝蛋白与人红细胞结合靶位之...

【目的】对小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)H蛋白胞外区(tH)细胞膜受体进行鉴定,为PPRV致病机制的研究奠定基础。【方法】克隆PPRV H基因胞外区(tH),在毕赤酵母(Pichia pasto-ris)中进行真核表达,纯化后免疫家兔,获得兔抗PPRV-tH蛋白特异性抗体;提取山羊外周血淋巴细胞膜蛋白,经SDS-PAGE检测后,湿转印法转印至NC膜,分别利用纯化的重组tH蛋白和PPRV进行病毒铺覆蛋白结合试验(VOPBA),对受体进行鉴定。【结果】成功克隆了1 653bp的PPRVtH基因,构建其重组酵母表达质粒pPIC9K-tH,...

为了鉴定对虾白斑病综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP110在中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃细胞中的结合蛋白,运用pET-32(a)+载体构建了1段含RGD模体的截短VP110原核重组表达质粒,转化大肠杆菌诱导表达后获得分子量为41 kD的截短重组VP110蛋白(rVP110)。以rVP110作为诱饵蛋白,运用pull-down实验结合蛋白质谱分析鉴定rVP110结合蛋白,结果显示,中国明对虾鳃细胞中的肌动蛋白和精氨酸激酶(arginine kinase,AK)与rVP110具有结合作用。利用PCR扩增中国明对虾AK编码基因,将其与表达载体pGEX-4T-1连接...

以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,运用亲和层析、SDS-PAGE、Western-blotting、抗真菌实验等技术探索对虾血蓝蛋白的抗黑曲菌活性。结果发现,血蓝蛋白在质量浓度为0.1～0.8 mg/mL时对黑曲霉(Aspergillus niger)生长表现出明显的抑制活性。在此基础上,选取0.2 mg/mL血蓝蛋白作用后的黑曲霉进行显微观察分析。光学显微镜观察结果表明,血蓝蛋白能抑制黑曲霉孢子生长。扫描电镜分析显示,在血蓝蛋白作用下,黑曲霉孢子囊萎缩,分生孢子集聚成团,菌丝裂解、扭曲、变短、无分生孢子囊。由此推测,对虾血蓝蛋白具有抗黑曲菌活性,其抗菌机制可...

以凡纳滨对虾(Litopenaeaus vannamei)为研究对象,运用亲和层析、PAGE、SDS-PAGE、Western-blotting和细菌凝集实验等方法探索凡纳滨对虾血蓝蛋白的细菌凝集活性。结果发现,血蓝蛋白对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻酸弧菌(Vibrio alginolyticus)、河弧菌(Vibrio fluvialis)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromona hy-drophila)和金黄色葡萄球菌(Stphylococcus aureus)等6种虾类致病菌具有凝集活性,其凝集活性大小为0.27~...

【目的】以大肠杆菌ATCC43889为试材,研究热胁迫处理对其细胞膜和膜蛋白的影响,为高温杀菌技术在食品工业中的应用奠定理论基础。【方法】研究ATCC43889分别经50℃、60℃和70℃热胁迫处理15 min并转接10次培养后,获得的3种抗热性ATCC43889菌株的细胞膜和膜蛋白变化。采用扫描电子显微镜分别观察原始对照菌株和3种抗热性菌株个体形态的变化;采用96孔微量酶标板法测定各菌株生物被膜生成能力的强弱;用气相色谱法测定各菌株细胞膜脂肪酸组成的变化及其差异;用差示扫描量热法测定各菌株细胞膜磷脂相变温度的变化;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法检测各菌株外膜蛋白表达的变化。【结果】大肠杆菌ATCC43889分别经50℃、60℃和70℃各10次热胁迫处理并转接10次培养后,其个体形态变化明显,经50℃热胁迫后,部分菌株由球状体变为长杆状;经60℃热胁迫后的菌株个体形态较50℃热胁迫处理的菌株细长;经70℃热胁迫处理后大部分菌株变成了更细长的杆状,大量的菌株聚集在一起,菌体表面呈凸凹不平的无规则形态。随着热胁迫温度的提高,ATCC43889抗热性菌株的生物被膜生成活力增大,其生物被膜生成能力增强,3种抗热性菌株的生物被膜生成能力与对照组相比差异显著(P0.05)。与对照的原始菌株相比,经过50℃、60℃和70℃各10次热胁迫处理并转接10次培养的菌株,缺失了3种脂肪酸,分别为C18:1n9c、C18:3n3和C21:0,随着热胁迫温度的提高,热胁迫菌株细胞膜中C13:0、C16:0和C17:0等饱和脂肪酸(SFA)及其总含量升高,而C14:1、C16:1、C17:1、C18:1n9t和C18:2n6t等不饱和脂肪酸(USFA)及其总含量降低,总SFA/总USFA比值增大,SFA/USFA比值越大,菌体细胞膜流动性越弱。随着热胁迫温度的提高,ATCC43889抗热性菌株细胞膜磷脂的熔点(Tm)升高,表明细胞膜磷脂的相变温度升高,细胞膜流动性降低,热胁迫温度越高,细胞膜流动性越低;随着热胁迫温度的提高,分子质量在63 kD和75 kD附近的条带颜色逐渐变深,分别经60℃和70℃各10次热胁迫并转接10次培养获得的2种抗热性菌株,其细胞外膜蛋白分子质量在48—75 kD均增加了特异条带;胁迫温度越高,一些外膜蛋白表达量及其种类增加,ATCC43889的耐热性越强。【结论】随着热胁迫温度的升高,ATCC43889个体形态变长,生物被膜生成能力增强,饱和脂肪酸含量升高,不饱和脂肪酸含量下降,细胞膜磷脂的相变温度升高,细胞膜流动性降低,一些外膜蛋白表达量提高、表达种类增加,菌株耐热性增强,这些变化有利于其适应不利的热胁迫环境,提高生存能力。

为建立大黄鱼肿大细胞病毒的培养方法，明确其分类地位，用肿大细胞病毒检测呈阳性的大黄鱼幼鱼病料（FD201807和SA201808）肾组织匀浆液感染鳜仔鱼细胞系（mandarin fish fry cell line-1，MFF-1）并连续传代，从病料组织匀浆液和细胞冻融液中提取病毒DNA，克隆病毒主要衣壳蛋白基因（mcp），测序后与NCBI Genebank中的虹彩病毒科肿大细胞病毒属病毒mcp以及2018—2020年所检出的15株大黄鱼肿大细胞病毒mcp进行比对分析。结果显示，病毒传至第4代才可引起MFF-1细胞病变，细胞病变的主要特征为细胞脱壁、变圆、折光度增强；感染时间越长脱壁细胞越多，同时培养液中的颗粒增加；透射电镜下可见感染细胞的细胞质散在大小为130～150 nm的六边形病毒粒子和空壳。感染细胞的病变周期随传代代次的增加而缩短，第15代次的FD201807株感染细胞80%细胞病变的时间为3 d，第15代次的SA201808株感染细胞80%细胞病变的时间为7～8 d。mcp序列比对和聚类分析发现SA201808株和FD201807株为虹彩病毒科、肿大细胞病毒属的不同病毒，SA201808株与FD201807株的mcp序列存在21个碱基差异，二者的mcp序列分别与大黄鱼虹彩病毒(Large yellow croaker iridovirus， LYCIV)LYCIV-Zhoushan（GenBank: MW139932.1）和花鲈虹彩病毒（Lateolabrax maculatus iridovirus， LMIV）（GenBank: MH577517.1）相近。15株从大黄鱼病料检出的病毒中，12株的mcp序列与SA201808株聚类；3株与FD201807聚类。本研究首次利用MFF-1细胞系分离培养了大黄鱼肿大细胞病毒，揭示了大黄鱼肿大细胞病毒存在差异，为更好地了解大黄鱼肿大细胞病毒提供了数据参考。

根据凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)网格重链蛋白(Clathrin Heavy Chain,CHC)的2个功能结构域Clathtin Propel Repeat(LvCHC1)和Clathrin Heavy Chain Repeat Homology(LvCHC2),分别设计2对特异性引物,扩增目的片段,并克隆至pBAD/gIIIA载体上,以E.coli Top10为宿主菌,在阿拉伯糖的诱导下表达出获得LvCHC1和LvCHC2重组蛋白表达产物。以Co(2+)亲和层析方法,获得纯化的

根据凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)网格重链蛋白(Clathrin Heavy Chain,CHC)的2个功能结构域Clathtin Propel Repeat(LvCHC1)和Clathrin Heavy Chain Repeat Homology(LvCHC2),分别设计2对特异性引物,扩增目的片段,并克隆至pBAD/gIIIA载体上,以E.coli Top10为宿主菌,在阿拉伯糖的诱导下表达出获得LvCHC1和LvCHC2重组蛋白表达产物。以Co(2+)亲和层析方法,获得纯化的

以0.1、1.0和10.0μg/mL 3种剂量脂肪细胞膜蛋白卵黄抗体处理体外培养的3T3-L1前脂肪细胞或经其诱导分化的脂肪细胞,采用四唑盐(MTT)比色法检测3T3-L1前脂肪细胞增殖能力,以乳酸脱氢酶漏出率为指标观察脂肪细胞膜蛋白卵黄抗体对脂肪细胞的细胞毒性,用流式细胞仪、Hoechst 33258荧光染色分析脂肪细胞凋亡情况以及油红O染色法测定脂肪细胞脂肪含量。结果表明:用不同质量浓度(0.1、1.0和10.0μg/mL)的脂肪细胞膜蛋白卵黄抗体处理可抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖,并影响脂肪细胞的脂肪合成(P<0.05),但对脂肪细胞无明显的细胞毒作用;还可见凋亡峰和典型的凋亡形态学改...

为研究凡纳滨对虾围食膜蛋白在IHHNV感染虾体过程中的作用,实验采用SMART技术构建了凡纳滨对虾肠道组织的全长cDNA文库,电子拼接获得了对虾围食膜蛋白基因全长cDNA序列,并进行了功能分析。全长cDNA文库的库容达1.05×106pfu/mL,重组率为95%。随机挑选1 600个克隆进行测序,去除载体后得到插入长度≥450 bp的有效序列1 531条,根据同源片段长度不小于100 bp,90%同源性的原则对这些序列归并unigene,得到unigene 399条。从所测克隆中得到一个围食膜蛋白基因,其cDNA序列长度为1 002 bp,编码由303个氨基酸组成的蛋白,基因序列比对发现该序列...