以凡纳滨对虾红体病病原菌副溶血弧菌为抗原,免疫兔获得高免血清,建立一种快速检测凡纳滨对虾红体病病原菌副溶血弧菌的ELISA技术。采用棋盘滴定法确定抗原和抗血清的最适工作浓度分别为106CFU·mL-1和1∶2000;病原菌检测灵敏度为每孔104CFU;抗血清与其它细菌标准菌株的交叉反应结果均呈阴性;阻断实验中的阻断率达75.88%;交叉反应和阻断实验结果表明该方法具有较高的特异性。将该方法标准化后检测了30份人工感染后的凡纳滨对虾和健康凡纳滨对虾,阳性检测率分别为93.3%和13.3%,表明该技术不仅能够检测已发病的凡纳滨对虾,而且能够检测带菌的凡纳滨对虾,这对于水产养殖业中疾病的早期诊断有着...

从患病凡纳滨对虾肝胰腺中分离出菌株20100612001,经人工感染实验证实,该分离菌株对凡纳滨对虾的半数致死量为1.44×106CFU/ml。形态学观察和革兰氏染色表明,该菌株为革兰氏阴性,无芽孢,有一根端极鞭毛;呈球杆状、球状、棒状或梨状且有两极浓染现象;在2216E培养基上为透明或半透明的圆形菌落,而在TCBS选择性培养基上为绿色或蓝绿色菌落。经Biolog碳源利用反应、脂肪酸气相色谱分析得出,该菌株与副溶血弧菌、需钠弧菌等的生理生化特性最相似;16SrD-NA序列测定表明,该菌株与弧菌属中几株病原菌的同源性均达到98.9%以上。在分子进化树中该菌株与副溶血弧菌Vibrio paraha...

为探明引起凡纳滨对虾细菌性红体病的病原,从病虾肝胰脏分离得到10株优势菌,经回归感染实验证实其为引起此次红体病的病原菌。Vitek与16S rRNA序列分析显示,分离株均为副溶血弧菌。基于dnaE-gyrB-recA-dtdS-pntA-pyrC-tnaA的多位点序列分型(multilocus sequencetyping,MLST)表明,这些菌株形成3个新序列型(ST),其中1株为ST413,7株为ST414,2株为ST415;ST413包含新等位基因型recA-166与tnaA-121,ST414则含有新等位基因型gyrB-219。MLST结果提示,这些副溶血弧菌分离株并非来自单一克隆,呈...

应用间接酶联免疫吸附试验(Indirect-ELISA)技术,建立了快速检测柱状黄杆菌的方法。结果显示:根据棋盘试验,确定最佳抗原包被浓度和免疫血清最佳工作浓度分别为1×106cfu/mL和1∶5000,酶标抗体最佳工作浓度为1∶10000。在该条件下,所建立的间接ELISA能检测出5×104cfu/mL的柱状黄杆菌,且与爱德华氏菌、哈维氏菌弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等常见鱼类致病菌无交叉反应。结果表明,所建立的间接ELISA可不经细菌培养而直接检测人工感染后草鱼鳃组织中的柱状黄杆菌,该方法对柱状黄杆菌的检测具有快速、敏感、特异、实用的优点。

病毒检测在预防和控制对虾病毒性疫病实践中具有重要的作用和意义。为了提高对虾病毒检测的快速性和简便性,建立了一种可同时检测6种对虾病毒的RT-PCR方法,并利用该方法对来自广西沿海地区的130份病虾样品中的黄头病毒(YHV)、白斑综合征病毒(W SSV)、桃拉病毒(TSV)、肝胰腺坏死病毒(HPV)、传染性皮下组织坏死病毒(IHHNV)以及杆状病毒(MBV)进行了检测。检测结果:白斑综合征病毒发病率最高,检出率高达73.8%;传染性皮下组织坏死病毒发病率为18.5%;桃拉病毒检出率为3.1%;未检出黄头病毒、肝胰腺坏死病毒和杆状病毒。该RT-PCR方法扩增得到的片段经测序,结果与标准毒株的核酸数...

对山东海阳和潍坊的2个养殖凡纳滨对虾群体取样,采用TaqManqPCR逐尾检测肝胰腺中的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)载量,再将提取的DNA样品按5并1(5∶1)、25并1(25∶1)、50并1(50∶1)、100并1(100∶1)和150并1(150∶1)进行并样,检测并样的EHP载量。设定不同临界循环数为假定灵敏度,定性判断各单尾检测阳性及并样组阳性,比较不同并样模式与检测阳性率、诊断灵敏度、诊断特异性等之间的关系以及定量的准确性。结果表明,检测灵敏度过低,会降低高并样率检测的准确性;阳性率在30%以上时,高并样率的检测结果与单样品检测相符性很好;高载量感染的阳性率不低于6.7%时,50∶1以内的并样能准确得出检测结果;低载量感染的阳性率不低于16%时,25∶1以内的并样能得出较好结果;高载量感染的1.3%阳性率和低载量感染的8%阳性率可能导致所有并样出现假阴性结果;各种并样模式均有很好的诊断特异性,50∶1并样的诊断灵敏度与OIE标准推荐的5∶1并样的接近;各并样检测的EHP载量与单样品检测平均值之比在0.27～2.83范围,二者存在极显著相关性,各种并样模式的定量检测结果在数量级水平能大致反映样品的平均EHP载量。本研究为水生动物疫病诊断和流行病学调查的样品检测提供了参考依据。

以凡纳滨对虾为研究对象,将其血清分别与溶藻酸弧菌,哈维氏弧菌,嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌等4种病原菌孵育,采用亲和蛋白质组学和Western-blotting等分子生物学方法纯化、鉴定和确证其中可与病原菌直接结合的蛋白。结果发现,与对照组相比4种病原菌与虾血清孵育5h后均可与对虾血清中分子质量约为75 000(p75)的蛋白相结合,而孵育15h后既可与p75相结合,还可与分子质量约为77 000(p77)的蛋白以及0~4种不同分子质量的蛋白相结合。经MALDI-TOF/MS分析和Mascot搜索引擎检索,p75和p77蛋白分别与凡纳滨对虾中分子质量约为75 000、77 000的2个血蓝蛋白...

【目的】研究果汁中耐热菌的免疫化学快速检测方法。【方法】以果汁中分离的耐热菌免疫家兔获得抗体,采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)原理建立果汁中耐热菌快速检测方法。【结果】首次成功建立并优化了耐热菌间接ELISA快速检测方法,检测限为5×10 4CFU/mL。实际检测时,通过对果汁样品集菌及预增菌,应用本研究建立的耐热菌间接ELISA快速检测方法,可以在24 h内给出果汁中耐热菌是否超过1 CFU/10 mL的检测结果,满足国内外果汁标准中耐热菌不超过1 CFU/10 mL的要求,检测时间比目前国内外普遍采用的KFL(Kruege...

以罗非鱼源无乳链球菌为抗原，免疫新西兰兔获得高效价的多克隆抗体；以此多克隆抗体作为一抗，羊抗兔Ｉｇ ｇ－ＨＲＰ作为酶标二抗，建立无乳链球菌的间接ＥＬＩＳＡ快速检测法。采用棋盘滴定法确定抗原与一抗的最佳工作浓度分别为１０６ ＣＦＵ／ｍ Ｌ和１∶１０ ０００；酶标二抗的最适工作浓度为１∶１０００。病原菌检测灵敏度为每孔１０３ ＣＦＵ。该方法标准化后具有快速、灵敏等特性，与海豚链球菌等其他常见水产病原菌无交叉反应；阻断实验中的阻断率达７２．０２％；交叉反应和阻断实验的结果显示该方法具有较高的特异性。将该方法标准化后检测了４４株２００７—２０１３年分离的罗非鱼无乳链球菌，阳性检测率为１００％；对人工感．．．

以施氏鲟(Acipenser schrenchii)细菌性败血症病原菌嗜水气单胞菌为抗原,免疫兔获得高免血清,建立一种快速检测施氏鲟细菌性败血症病原菌嗜水气单胞菌的ELISA技术。结果显示:采用棋盘滴定法确定抗原和抗血清的最适工作浓度分别为107CFU/mL和1∶20000;病原菌检测灵敏度为每孔104CFU;抗血清与其它细菌标准菌株的交叉反应结果均呈阴性;阻断实验中的阻断率达66.88%;交叉反应和阻断实验的结果表明该方法具有较高的特异性。将该方法标准化后检测了22份人工感染后的施氏鲟和健康施氏鲟,阳性检测率分别为90.9%和13.6%,表明该技术不仅能够检测已发病的施氏鲟,而且能够检测带菌...

【目的】检测广西沿海地区凡纳滨对虾源副溶血弧菌的耐药性及部分相关耐药基因的携带状况,为凡纳滨对虾疾病防控以及副溶血弧菌耐药机制的深入研究提供基础数据。【方法】采用K-B纸片扩散法检测30株分离自广西钦州市、防城港市和北海市的副溶血弧菌对12种常见抗生素的耐药性,以PCR方法检测氨基糖苷类耐药基因ant(3")-I、磺胺类耐药基因Sul1、四环素类耐药基因tet(A)和β-内酰胺类耐药基因TEM在副溶血弧菌中的携带状况,通过SPSS软件进行菌株耐药表型和耐药基因的相关性分析。【结果】30株副溶血弧菌对试验药物的敏感率以氟苯尼考最高(96. 7%),其次是链霉素(90. 0%);耐药率以磺胺二甲嘧啶和青霉素G最高(均为96. 7%)。优势耐药谱型是SDM/SMD/PG/AMP和SMD/PG/AMP。PCR检测结果,ant(3")-I、Sul1、tet(A)、TEM基因的检出率分别为6. 7%、43. 3%、0. 0%和13. 3%。受试菌株共包含ant(3")-I-Sul1+tet(A)-TEM-、ant(3")-I-Sul1-tet(A)-TEM-、ant(3")-I-Sul1-tet(A)-TEM+、ant(3")-I+Sul1-tet(A)-TEM-和ant(3")-I-Sul1+tet(A)-TEM+5种耐药基因型,其中优势耐药基因型是ant(3")-I-Sul1+tet(A)-TEM-和ant(3")-I-Sul1-tet(A)-TEM-,各占40. 0%。相关性分析结果,氨基糖苷类、磺胺类、四环素类、β-内酰胺类抗生素耐药表型与对应耐药基因之间均未发现存在显著相关性。【结论】30株广西沿海凡纳滨对虾源副溶血弧菌对氟苯尼考最敏感,对磺胺二甲嘧啶和青霉素G耐药性最强;受试菌株共包含5种耐药基因型,优势耐药基因型是ant(3")-I-Sul1+tet(A)-TEM-和ant(3")-I-Sul1-tet(A)-TEM-。菌株的4类抗生素耐药基因与耐药表型之间均未发现存在显著相关性。

【目的】检测广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌的耐药性和整合子—基因盒携带情况,为凡纳滨对虾副溶血弧菌病的防控及该菌耐药分子机制研究提供基础数据。【方法】采用K-B纸片扩散法测定副溶血弧菌对16种抗菌药物的敏感性;采用PCR检测I、II和III型整合子及I型整合子可变区基因盒的携带情况,并分析菌株整合子—基因盒携带情况与耐药性的相关性。【结果】104株广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌对16种抗菌药物表现出不同程度的敏感性,其中,对氟苯尼考(FFC)的敏感性最高,敏感率达82.7%;对磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺二甲嘧啶(SM2)和复方磺胺嘧啶(SD)的耐药性较强,耐药率达93.3%～100.0%。在2013-2018年,广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌共有20种耐药谱,其中优势耐药谱为SD/SM2/SMM/SMD/SXT/RAD。PCR扩增结果表明,I型整合酶int1基因检出率为64.4%,sul1和qacEΔ1基因检出率分别为25.0%和27.9%。int1、sul1和qacEΔ1基因均为阳性的菌株检出率为22.1%。在int1、sul1和qacEΔ1基因均为阳性的菌株中,有6株检出携带基因盒,基因盒种类包括blaCTX-M-2-aadA1和blaVIM-60-aadA1-aacA。所有菌株均未检出II和III型整合酶基因。int1和qacEΔ1基因在广西北海市、钦州市和防城港市分离菌株中的检出率差异显著(P0.05,下同);头孢拉定(RAD)的耐药表型与blaCTX-M-2和blaVIM-60基因、新霉素(NEO)的耐药表型与aadA1和aacA基因、磺胺类的耐药表型与sul1基因均无显著相关性。【结论】广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌对氟苯尼考的敏感性最高,可考虑将该抗菌药物作为广西凡纳滨对虾副溶血弧菌病防治的备选药物。副溶血弧菌对大部分抗菌药物的耐药表型与int1基因间未检测到显著相关性、基因盒与相应抗菌药物的耐药表型间相关性也不显著,但I型整合子的流行增加了广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌产生多重耐药的可能性,因此应加强对弧菌整合子—基因盒的监控。

针对烟草青枯病的防控,开发快速、高效的病原菌检测方法是必要的。环式等温扩增(LAMP)是一种在等温条件下快速完成靶标基因扩增的新方法。将青枯病菌贵州分离株FQY4基因组序列(NCBI号:CP004013)与其他已发表菌株序列比对分析,确定编码鞭毛蛋白的fliC基因的保守区域可被选作检测靶标。根据LAMP原理以及靶标序列的特点,设计了一组由6条引物组成的环式等温扩增反应体系。结果表明:61℃条件下孵育45min,可完成对青枯病病原菌单菌落和带菌烟草叶片的检测,结果判定可以通过颜色变化被肉眼直接识别,也可以通过琼脂糖凝胶电泳检测。通过这种新方法,可以实现对青枯病菌菌落的快速鉴别,还可以用于对田间疑...

为了从对虾体内分离出的菌株中快速筛选出蜡样芽孢杆菌和溶藻胶弧菌,将蜡样芽孢杆菌与溶藻胶弧菌作为抗原,免疫SPF新西兰大白兔,获得免疫血清,效价均高于1:2000。将免疫兔血清作为一抗,HRP-羊抗兔血清作为二抗,建立了蜡样芽孢杆菌和溶藻胶弧菌快速检测的间接ELISA方法。此方法中,兔抗血清最佳稀释度为1:10000,菌液最佳包被浓度为106 CFU/ml;HRP-羊抗兔血清最佳稀释浓度为1:1000,可检测细菌最低浓度为104 CFU/ml。抗蜡样芽孢杆菌血清与苏云金芽孢杆菌有交叉反应,抗溶藻胶弧菌血清与其亲缘相近菌株无交叉反应,具有较强的特异性。2012年和2013年,分别从斑节对虾、中国对...

以迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)WY28作为抗原,免疫新西兰兔,获得效价为1:2048的多克隆抗体;以此多克隆抗体作为一抗,山羊抗兔IgG-HRP作为酶标二抗,建立迟缓爱德华氏菌的间接ELISA快速检测法。采用棋盘滴定法确定抗原与一抗的最佳工作浓度分别为106CFU·mL-1和1:10000;酶标二抗的最适工作浓度为1:1000。病原菌检测灵敏度为每孔103CFU。该方法标准化后具有快速、灵敏等特性,与肠杆菌科其他细菌参考菌株无交叉反应,具良好的特异性。对养殖场发病大菱鲆(Scophthalmus maximus)和半滑舌鳎中分离的细菌菌株进行检测,从56株分离菌株中检...