精氨酸激酶(arginine kinase,AK)在调节无脊椎动物磷酸精氨酸与ATP之间能量平衡的过程中具有重要作用。在前期工作基础上,设计特异引物,以凡纳滨对虾肌肉组织cDNA为模版,克隆得到了1071bp的凡纳滨对虾精氨酸激酶的完整开放阅读框;将它克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上,转化BL21(DE3)菌株,经诱导后表达出GST-AK融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗血清,经检测该抗原与抗体识别良好。利用得到的抗体对凡纳滨对虾AK在蛋白质水平上的特异性表达进行分析发现,精氨酸激酶在对虾的肌肉、心脏、神经、血细胞和胃组织中具有高的表达量,而在眼柄、肝胰腺、鳃和皮肤...

从猪外周血淋巴细胞中克隆猪CD40L基因,构建表达载体pET-CD40L,转化大肠杆菌BL21(DE),表达获得相对分子质量约为48×103的重组融合蛋白。以纯化的重组蛋白免疫新西兰兔,获得抗猪CD40L的特异性抗体。间接ELISA检测到多克隆抗体效价达到1:12 800,Western-blot检测结果表明,得到的抗体既可与纯化的CD40L蛋白特异性结合,又可与表达猪CD40L的重组杆状病毒特异性结合。

为深入研究鹅催乳素受体(PRLR)的功能,构建了含鹅PRLR胞外域编码序列exPRLR的原核表达质粒exPRLR-pET-28a(+),通过转化E.coli Roster建立了稳定的原核表达系统,在IPTG诱导下获得了PRLR胞外域的重组exPRLR。以重组exPRLR为抗原免疫家兔,获得了兔抗鹅exPRLR的抗血清。Western blot分析证明该抗血清可特异识别由原核生物表达的重组exPRLR。进一步分析成年母鹅的组织蛋白,发现成年鹅中可能至少存在3种相对分子质量不同的PRLR蛋白异形体。

应用RACE技术克隆了青虾(Macrobrachium nipponense)的Hc基因全长cDNA序列,并对该基因序列特征进行了分析。青虾Hc基因cDNA全长2 235 bp,包括10 bp的5′末端非翻译区(UTR),2 074 bp的开放阅读框(ORF),151 bp的3′UTR,开放阅读框编码688个氨基酸。蛋白相似度比对显示,青虾血蓝蛋白含有典型的6个保守的铜离子结合位点。系统进化树分析表明,青虾Hc与脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)Hc聚在一起,具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示,Hc基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在肝胰腺中最高;使用荧光定...

【目的】制备灰茶尺蠖(Ectropis grisescens Warren)固醇转运蛋白(SCP)的多克隆抗体,并检测灰茶尺蠖SCP2蛋白在灰茶尺蠖不同组织中的表达情况,为进一步研究SCP2对胆固醇的转运和利用机制以及其生物学功能奠定基础。【方法】以灰茶尺蠖5龄1 d幼虫中肠cDNA为模板,应用PCR技术扩增得到EgSCP2片段,将EgSCP2目的片段连入pMD18-T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析该基因序列的准确性及编码蛋白的分子质量。以测序正确的EgSCP2基因片段为模板,扩增EgSCP2的开放阅读框,通过BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶连接到原核表达载体pET32a中,并转化大肠杆菌BL21 (DE3)进行原核表达,离心收集并超声波破碎菌体,取上清液和沉淀分别进行SDS-PAGE检测,在不同温度、不同IPTG终浓度条件下优化EgSCP2重组蛋白表达条件。经Ni-NTA树脂层析柱纯化得到EgSCP2重组蛋白。将该蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗EgSCP2血清抗体,采用间接ELISA方法测定了该血清抗体的效价,并通过Western blotting检测EgSCPx和EgSCP2蛋白在灰茶尺蠖不同组织中的表达情况。【结果】扩增得到EgSCP2基因开放阅读框(ORF)全长为441 bp,编码146个氨基酸,预测编码蛋白的分子质量为16 ku。优化蛋白诱导条件的试验表明,28℃、IPTG浓度为1.0 mmol/L时,EgSCP2重组蛋白表达量最高,该条件下通过大肠杆菌表达的EgSCP2重组蛋白分子质量约为34 ku,其大小与预期结果一致,且其在上清液和沉淀中均有表达。间接ELISA法检测结果表明,制备的兔抗EgSCP2抗体具有较好的灵敏度,效价达到1∶256 000。Western blotting检测结果显示,58 ku EgSCPx在5龄2 d灰茶尺蠖的表皮、脂肪体和中肠均有表达,且在中肠的表达量远高于表皮和脂肪体;16 ku EgSCP2仅在表皮和脂肪体中表达。58 ku EgSCPx蛋白在4龄和5龄灰茶尺蠖的幼虫中肠大量表达,在蛹期少量表达,在成虫期几乎不表达。【结论】纯化获得了EgSCP2重组蛋白,其最优表达条件为温度28℃、IPTG终浓度1.0 mmol/L;制备了高效价的灰茶尺蠖EgSCP2多克隆抗体,明确了灰茶尺蠖EgSCPx蛋白在不同组织中的表达规律。

【目的】克隆猪Jiv蛋白核心区的2 112bp的基因片段,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达和纯化,制备抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。【方法】利用RT-PCR方法,从猪脾脏组织RNA中扩增得到猪Jiv基因,将其克隆到pMD19-T载体并测序,以此为基础构建原核表达载体pET32a-Jiv,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导表达,获得大量包涵体形式的猪Jiv融合蛋白。通过镍离子螯合层析柱对表达的目的蛋白进行纯化,对纯化后的包涵体蛋白进行透析复性,以每只新西兰白兔400μg蛋白的初次免疫剂量和500μg蛋白的加强免疫剂量进行免疫,共免疫5次,采集血清,采用间接E...

S期激酶相关蛋白1(Skp1)是SCF型E3泛素连接酶途径的核心蛋白,在真核生物的细胞周期、转录调控、信号传导等细胞进程中发挥关键作用。为了深入研究Skp1的基因功能,通过反转录PCR扩增黄瓜Skp1基因的全长阅读框,Skp1基因全长阅读框由468个核苷酸组成,共编码155个氨基酸,将其通过酶切连接的方式克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中,获得重组载体pETSkp1,PCR验证及克隆测序确定开放阅读框的正确性。将重组质粒pETSkp1转化大肠杆菌BL21菌株,通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析

为探讨玉米AGPL2在籽粒发育时期淀粉积累过程中的功能机制,通过AGPL2基因克隆和构建带有GST标签的原核表达载体PGEX-6 T-1-AGPL2,并利用大肠杆菌诱导表达体系,用0. 5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在28℃条件下诱导表达6 h后,GST-AGPL2融合蛋白能够得到高水平表达,然后利用GST(Glutathione S-transferase)标签蛋白纯化介质进行亲和层析纯化,能够得到质量较高的GST-AGPL2融合蛋白;利用纯化所得的GST-AGPL2重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了AGPL2多克隆抗体,分离并纯化抗血清,然后用rTEV Protease去除抗原GST-AGPL2融合蛋白的GST标签,并用纯化后的AGPL2多克隆抗体进行Western Blot检测,结果发现,AGPL2多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性,可用于检测纳克级抗原蛋白;并利用Western Blot方法研究了AGPL2蛋白在玉米不同组织和不同授粉时期胚乳中的分布和表达模式,结果显示,AGL2蛋白在玉米不同组织中的表达具有组织特异性,且在胚乳中含量最高。AGPL2蛋白在玉米胚乳不同授粉时期表达量先增加后降低,且在授粉中期达到最大值。其结果与玉米籽粒发育过程中淀粉的积累规律一致,说明AGPL2主要存在于玉米胚乳中,且可能参与淀粉的合成,也说明AGPL2多克隆抗体具有很好的特异性,能够识别玉米体内的AGPL2抗原。

实验进行了青鱼(Mylopharyngodon piceus)Dazl基因的原核表达,兔抗青鱼源Dazl多克隆抗体的制备及抗体的特异性验证。首先将青鱼Dazl基因的编码区利用重组表达引物从pCS2-MpDazl质粒中扩增出来,经酶切后连接到pET-28a载体中,构建pET-28a-MpDazl重组表达载体。然后将pET-28a-MpDazl重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,利用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得分子量为27 kD的Dazl重组蛋白。将纯化的Dazl重组蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,抗体的效价和特异性通过ELISA法和Western blot检测。结果:成功构建重组表达载体pET-28a-MpDazl;以0.5 mmol/L IPTG在37℃条件下诱导4 h可获得高效表达的Dazl重组蛋白;制备的兔抗青鱼Dazl多克隆抗体能够特异性识别原核表达Dazl蛋白、青鱼卵巢的内源Dazl蛋白以及细胞中过表达的Dazl蛋白,并证实了青鱼Dazl蛋白在性腺中表达的特异性。

抗苗勒氏管激素(anti-mullerian hormone,AMH),也称苗勒氏管抑制物质(mullerianin hibiting substance,MIS),为肽类生长因子,属于TGF-β生长和分化因子家族。为研究AMH对奥利亚罗非鱼性腺发育的作用,应用DNAstar软件分析罗非鱼AMH基因的抗原性,选择抗原性较强的22～243氨基酸作为目的片段构建了AMH的原核表达载体并进行融合表达。首先利用RT-PCR方法从性腺中扩增出长约663bp的目的序列AMH基因,克隆至T载体中,经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将此片段克隆到表达载体pGEX-5x-1中构建重组表达质粒pGEX-A...

【目的】克隆家蚕精氨酸激酶基因,分析其基因结构与表达特性,为揭示无脊椎动物体内能量代谢调节规律提供重要基础。【方法】通过分析家蚕EST、利用RACE法和基因组文库筛选法克隆了家蚕精氨酸激酶(BmAK,Bombyx mori arginine kinase)基因,并对其基因结构和表达特性进行了分析。【结果】克隆了BmAK基因,cDNA全长为1 268bp,编码355个氨基酸,具有精氨酸激酶典型的酶活性部位氨基酸序列,酶活性中心位点氨基酸和能形成离子偶结构氨基酸;该基因由2个外显子和1个内含子组成;5′调控序列存在BRCZ、E74A、FTZ等多个潜在转录因子结合位点,但没有TATA盒启动子序列;该...

根据GenBank中猪SIRT1mRNA序列设计引物,使用杜大长商品猪大脑RNA经RT-PCR扩增得到猪SIRT1基因全长表达序列,通过Ω-PCR将SIRT1蛋白末端抗原表位序列插入载体pET-28a(+),在大肠杆菌中表达并纯化得到45ku大小的蛋白,以其免疫新西兰大白兔并制备出抗体滴度达212的多克隆抗体。结果表明,成功制备出可以特异性识别猪SIRT1蛋白的抗体。

为了解H~+/肌醇转运蛋白(H~+/myoinositol transporter,HMIT)基因在肌醇跨膜转运中发挥的作用，克隆了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的HMIT基因，命名为Lv-HMIT,并分析了Lv-HMIT的结构和表达特征。Lv-HMIT的开放阅读框为1 650 bp,编码549个氨基酸。物理性质显示，它是一种不稳定的亲水性蛋白质，二级结构与三级结构预测都显示其主要由α螺旋和无规则卷曲为主；跨膜结构分析显示，Lv-HMIT存在11个跨膜螺旋结构；亚细胞定位显示，它分布于质膜、内质网和线粒体。多重比对发现，Lv-HMIT的跨膜结构和糖基化位点都比较保守。系统进化显示，Lv-HMIT与雪蟹(Chionoecetes opilio)的HMIT先聚为一支，再与其他节肢动物聚类。实时荧光定量PCR结果显示，Lv-HMIT mRNA在肝胰腺中表达量最高，其次是鳃，在心、胃、眼柄、肠、肌肉和血细胞等组织中有少量表达。Lv-HMIT mRNA从无节幼体期检测到表达，在变态至蚤状幼体、糠虾幼体和仔虾各阶段时都呈现上调表达，说明它可能与幼体变态发育过程有关。十足目虹彩病毒(decapod iridescent virus 1, DIV1)感染24 h后，Lv-HMIT mRNA在肝胰腺中表达显著下调，而鳃中表达量显著上调，显示它参与了对虾对病毒的免疫响应过程。研究结果可为深入了解凡纳滨对虾HMIT的结构功能及在对虾幼体发育、病毒免疫的调控机制提供基础数据。

经过CM-纤维素批量层析、Separdex G-100柱层析、DEAE-纤维素柱层析等步骤,从凡纳滨对虾肌肉组织分离得到精氨酸激酶,经SDS-PAGE检测达到电泳纯,分子量约为40kDa。对该酶的性质进行分析结果表明,精氨酸激酶的最适作用温度为55℃,当温度高于65℃时,酶活力显著下降;pH8时酶活力较高,低浓度的精氨酸对酶活力有促进作用,高浓度时表现抑制作用,而底物类似物精胺和氨基胍则对酶促反应表现出完全的抑制。NaCl,KCl对酶的活力具有促进作用,低浓度(10mmol.L-1)MgCl2对酶活力表现出激活作用,而CuCl2与MnCl2则表现出完全抑制酶活力,CaCl2与ZnCl2在低浓度...