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[期刊] 渔业科学进展
[作者]
杜欣军 张伟伟 孙伟英 王硕
根据相近物种的同类基因设计引物,从凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei肌肉组织中克隆获得原肌球蛋白基因(TPMS),长度为901bp,其中包含长度为852bp的完整开放阅读框,编码原肌球蛋白分子量为32.8kDa;RT-PCR结果显示,原肌球蛋白在心、肝胰腺、胃、鳃、肠和肌肉组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,在鳃中表达量最低;将原肌球蛋白基因构建原核重组表达载体TPMS-pET30a,转化受体菌株BL21(DE3)并利用IPTG诱导后能够大量表达,蛋白分子量为38.2kDa;经优化,IPTG的最适诱导浓度为0.05mmol/L,最适诱导时间为4h;经过亲和纯化后,能够得到纯度9...
关键词：
凡纳滨对虾 过敏原 原肌球蛋白 表达
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李文兰 盛小伟 高永华 陈晓汉 马宁 熊建华
以生长性状分离凡纳滨对虾家系的肌肉组织,构建凡纳滨对虾生长性状差减cDNA文库,斑点杂交筛选获得MLC基因,克隆获得全长编码区序列。序列分析表明序列包含462 bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为153氨基酸,预测的分子量为17.5ku,等电点为4.67。通过荧光定量PCR的方法研究了MLC基因在凡纳滨对虾不同组织和不同生长期的肌肉组织中表达情况,显示MLC基因在凡纳滨对虾的心脏、肝胰腺、肌肉、胃、肠、眼柄、鳃和血等组织或器官中都有表达,在肌肉组织中表达量最高,在肝胰腺中表达量最低;在日龄为45 d的对虾肌肉组织中表达量最高,在日龄为10 d的对虾肌肉组织中表达量最低。
[期刊] 水产学报
[作者]
梁银龙 曹敏杰 郭川 苏文金 张凌晶 刘光明
通过分子生物学技术方法,分别克隆得到锯缘青蟹(Scylla serrata)、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)和三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的原肌球蛋白基因序列。测序结果表明,三个基因的序列长度均为855 bp,编码284个氨基酸残基,三者氨基酸序列同源性为99.3%。三种蟹的原肌球蛋白基因序列与GenBank中其他甲壳类动物的原肌球蛋白具有很高的同源性。将锯缘青蟹的原肌球蛋白基因与pGEX-4T-3载体连接后,经IPTG诱导得到分子量约为61 ku的融合表达蛋白。通过与甲壳类过敏患者血清的免疫印迹反应,证实融合表达的原肌球蛋白具有过敏原性,...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
吴任 谢数涛 孙勇 完颜小青 张其中
将凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)热休克蛋白70基因(heat shock protein 70,HSP70)克隆到原核表达载体pET-3c中,经酶切和DNA测序鉴定后,将重组质粒转入表达宿主BL21(DE3),在不同温度、时间下经IPTG诱导表达,收集菌液,进行SDS-PAGE和Western blot检测,并用软件Bandscan分析蛋白表达水平。结果表明,成功构建含凡纳滨对虾HSP70基因的重组表达载体pET-3c/HSP70,表达的目标蛋白相对分子量约为72 kD,并能与小鼠抗人HSP70抗体特异性结合。37℃诱导5 h目标蛋白表达量最高;但25℃诱导目标蛋白的可...
关键词：
凡纳滨对虾 热休克蛋白70 原核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
吴华俊 蔡紫玲 罗淋淋 林同
为阐明松墨天牛肌肉收缩机理和相关基因表达模式,用构建c DNA文库方法,从松墨天牛c DNA中克隆到松墨天牛肌球蛋白轻链2基因,命名为Ma MLC-2(Gen Bank:KM371003)。该基因c DNA为882 bp,其中开放阅读框(ORF)为618 bp,编码205个氨基酸,推测的蛋白等电点为4.66,分子量为22.26 k Da。Ma MLC-2的氨基酸序列与赤拟谷盗同源性最高,为96%,与东方蝼蛄等8种昆虫同源性为85%~88%。松墨天牛与赤拟谷盗处在系统发育树的同一分支上。Ma MLC-2属于亲水性氨基酸,存在2个EF-hand结构域,长度均为29个氨基酸,其中第1个EF-hand...
[期刊] 水产学报
[作者]
韩芳 王志勇 王晓清
食物过敏是人类常见的一种过敏性疾病,主要由食物中的蛋白质引起。原肌球蛋白(tropomyosin,TPM)是食用虾蟹等甲壳动物引起过敏反应的主要致敏物质。研究从日本囊对虾肌肉组织中克隆了TPM基因,进行了原核表达和蛋白质纯化,并进一步制备了相应的抗体。Western-blotting分析表明原肌球蛋白在日本囊对虾组织中普遍表达,并且肌肉组织中表达量最高而鳃和皮肤组织中表达量最低。研究结果为对虾过敏性疾病的诊断和治疗以及脱敏食品开发等奠定了理论基础。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
颜婕 刘红 方昱 蔡生力
利用ｃＤＮＡ末端快速扩增技术克隆出凡纳滨对虾（ＬｉｔｏｐｅＮＡｅｕｓ ｖＡＮＮＡｍｅｉ）核自身抗原精子蛋白（ＮＡｓｐ）基因，ＮＡｓｐ基因ｃ ＤＮＡ全长２２５８ ｂｐ，其中包括９２ ｂｐ ５′端非编码区，１４７ ｂｐ ３′端非编码区及２０１９ ｂｐ开放阅读区，编码６７３个氨基酸，预测分子量为７４．１８ ｋ Ｄ。该序列已提交至ＧｅＮ ｂＡＮｋ，序列号为ｋｔ２７４８１１。在Ｎｃｂｉ上进行序列比对后发现，其与斑节对虾（ｐｅＮＡｅｕｓ ｍｏＮｏＤｏＮ）ＮＡｓｐ序列相似性最高，为９０％。采用荧光定量ｐｃＲ方法测定了不同发育时期卵巢与肝胰腺中ＮＡｓｐ ｍ ＲＮＡ相对表达水平，结果表明，ＮＡｓｐ在卵巢中的表达．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
邹枘峰 李丹蕾 张亦陈 刘逸尘 耿绪云 孙金生
含溴结构域蛋白(bromodomain/BRD-containing protein, BCP)是一种高度保守的蛋白,属于含溴结构域和额外终端域(bromodomain and extraterminal, BET)蛋白超家族成员。该蛋白在有丝分裂过程中通过募集不同的染色体修饰蛋白,达到了广泛调控基因复制及转录的作用,其表达水平的变化常与肿瘤及炎症的发生相关联。本研究根据实验室前期转录组结果提示信息,首次获得了凡纳滨对虾2 229 bp的BCP基因cDNA序列(LvBRD, GenBank注册号:MH638256),利用在线软件进行了生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR (qPCR)技术分析了该基因的组织表达特征和其在对虾白斑综合征病毒(WSSV)、苏云金芽孢杆菌以及副溶血性弧菌侵染过程中的表达变化特征。结果显示,LvBRD编码的蛋白质有一个保守的可以参与细胞周期调控过程的溴结构域(bromodomain,BRD);组织表达分析表明该基因主要在凡纳滨对虾血细胞、肝胰腺和鳃组织中表达;在WSSV和病原菌感染后早期(0.5～12 hours past infection,hpi),Lv-BRD的表达可以被显著诱导,在血细胞中呈明显上调的表达趋势,表明该基因在一定程度上参与了对虾体内由病原引发的天然免疫应答反应。上述研究结果为进一步研究Lv-BRD基因在对虾抗病毒免疫及干扰素调控过程中的功能和作用机制奠定了基础。
[期刊] 水产学报
[作者]
李昕 夏西超 宁黔冀
为探讨咪唑类物质KK-42可能的作用机制,首次克隆了热激蛋白90(HSP90)部分mRNA序列,研究了HSP90以及HSP70基因的时空表达以及KK-42对其表达的影响。将体长3.5～5.0cm凡纳滨对虾幼虾随机分为2组,分别用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液或不含KK-42的溶液浸泡处理1min,之后在相同条件下常规饲养。结果显示,HSP90和HSP70在凡纳滨对虾大颚器官、眼柄、肌肉和肝胰腺都有表达,其中,肝胰腺中的表达水平较高。实验期间,肝胰腺中两种HSPmRNA水平虽有一定波动,但含量相对较低;KK-42处理可显著诱导肝胰腺HSP的表达,在处理后第1、2、3天,HSP70和...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
徐秋芳 陈晴晴 倪海平 李硕 张金凤 周益军
【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白(tropomyosin,Tm)能与水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因(Tm),将其在原核细胞中进行表达,纯化Tm蛋白,免疫大白兔并制备其多克隆抗体,为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框(open reading frame,ORF)。提取灰飞虱总RNA,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF,连接至pMD-18T载体后进行测序...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
顾冰宁 刘欣 沈和定 王冬凤 杨铁柱 朱敏 史艳梅 李柏航
肌球蛋白是动物体内重要的功能性马达蛋白,调控机体的信号传导、肌肉收缩和细胞器运动,为探究肌肉在瘤背石磺(Onchidium struma)由海洋向陆地进化过程中发挥作用的分子机制,实验以石磺科4种贝类转录组数据为基础,采用RACE方法从瘤背石磺肌肉中首次克隆到肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MyHC)基因cDNA的全长并进行组织表达分析。研究结果显示,瘤背石磺MyHC基因cDNA全长为7566 bp,包括5895 bp的开放阅读框,228 bp的5’端非翻译区,1443 bp的3’端非翻译区,共编码1964个氨基酸。预测该基因编码的蛋白质由31713个原子组成,分子式为C_(9765)H_(15897)N_(2849)O_(3150)S_(52),分子量约为225.28 kDa,理论等电点为5.56,N端信号肽具有29个氨基酸长度。瘤背石磺MyHC具有2个保守结构域MYSc_class_Ⅱ和Myosin_tail_l,且亲水性氨基酸集中在Myosin_tail_l区。系统进化树分析显示,瘤背石磺MyHC与光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)MyHC的亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,MyHC基因在各个组织中均有表达,腹足和背部皮肤表达量最高,腹部皮肤、口球、肺囊中高表达,肝胰腺、蛋白腺、两性腺中微量表达(P<0.05)。MyHC基因在瘤背石磺的主要运动器官腹足中高表达,说明肌肉运动对瘤背石磺湿地环境的两栖适应性具有至关重要的作用。实验结果为今后进一步研究瘤背石磺肌球蛋白重链基因进行原核表达及多克隆抗体的制备奠定了良好基础,更为深入探讨海洋无脊椎动物从海洋向陆地进化的研究提供有参考意义的分子依据。
关键词：
瘤背石磺 MyHC 基因克隆 组织表达
[期刊] 水产学报
[作者]
李媛媛 蔡生力 刘红
卵黄磷蛋白作为卵黄蛋白的主要成分,可为甲壳动物胚胎和早期幼体发育提供能量,为研究其来源及合成规律,实验应用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法检测了凡纳滨对虾和罗氏沼虾性腺不同发育时期卵巢和肝胰腺两种组织中卵黄蛋白原mRNA的表达水平。结果发现,凡纳滨对虾和罗氏沼虾的卵巢和肝胰腺中都有卵黄蛋白原mRNA的表达。随着卵巢的发育,凡纳滨对虾卵巢中卵黄蛋白原mRNA的相对表达量在前5个阶段不断增加,分别为1.1,5.9,10.4,26.9,85.0,恢复期急剧减少,为1.6。肝胰腺中的相对表达量也不断增加,分别为1.3,3.3,7.1,37.3,51.6,恢复期急剧减少,为1.0。罗氏沼虾肝胰腺中...
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
金利华 骆晶晶 林圣彩 叶志云
根据G蛋白Gβ1亚基的保守序列设计简并引物,通过简并PCR和RACE技术,克隆到凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)Gβ1基因的全长cDNA序列。利用Blast、DNAstar和Genedoc软件分析,发现该Gβ1编码的蛋白序列与其他物种已知的Gβ1序列具有相当高的保守性,将它命名为pvGβ1。免疫共沉淀分析发现pvGβ1能在体外适当条件下与对虾Gαs或Gαq相互结合。Westernblot-ting分析发现,pvGβ1在对虾身体各部位都有广泛分布,尤其在脑神经、眼和眼柄有大量表达。说明了Gβ1在对虾的神经系统和光信号传导等生命过程中的重要性。
关键词：
G蛋白 凡纳滨对虾 克隆
[期刊] 海洋渔业
[作者]
刘洪涛 杨明秋 汪坤 何玉贵
为了解H~+/肌醇转运蛋白(H~+/myoinositol transporter,HMIT)基因在肌醇跨膜转运中发挥的作用，克隆了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的HMIT基因，命名为Lv-HMIT,并分析了Lv-HMIT的结构和表达特征。Lv-HMIT的开放阅读框为1 650 bp,编码549个氨基酸。物理性质显示，它是一种不稳定的亲水性蛋白质，二级结构与三级结构预测都显示其主要由α螺旋和无规则卷曲为主；跨膜结构分析显示，Lv-HMIT存在11个跨膜螺旋结构；亚细胞定位显示，它分布于质膜、内质网和线粒体。多重比对发现，Lv-HMIT的跨膜结构和糖基化位点都比较保守。系统进化显示，Lv-HMIT与雪蟹(Chionoecetes opilio)的HMIT先聚为一支，再与其他节肢动物聚类。实时荧光定量PCR结果显示，Lv-HMIT mRNA在肝胰腺中表达量最高，其次是鳃，在心、胃、眼柄、肠、肌肉和血细胞等组织中有少量表达。Lv-HMIT mRNA从无节幼体期检测到表达，在变态至蚤状幼体、糠虾幼体和仔虾各阶段时都呈现上调表达，说明它可能与幼体变态发育过程有关。十足目虹彩病毒(decapod iridescent virus 1, DIV1)感染24 h后，Lv-HMIT mRNA在肝胰腺中表达显著下调，而鳃中表达量显著上调，显示它参与了对虾对病毒的免疫响应过程。研究结果可为深入了解凡纳滨对虾HMIT的结构功能及在对虾幼体发育、病毒免疫的调控机制提供基础数据。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
彭金霞 蒋小珍 房振峰 殷勤 韦嫔媛 陈晓汉
通过对已知耐寒候选基因-COPE基因的克隆和研究,为凡纳滨对虾耐寒性状的分子机理研究提供依据。运用同源克隆和RACE-PCR技术获得凡纳滨对虾COPE基因(LvCOPE)全长cDNA序列,对其进行了生物信息学分析,采用荧光定量PCR研究了LvCOPE基因的组织表达谱及其在低温胁迫下表达量的变化。结果显示,LvCOPE cDNA全长1217 bp,包含888 bp开放阅读框,编码296个氨基酸残基,具有保守的TPR结构域。各物种COPE蛋白序列构建的系统进化树能准确反映各物种间的进化关系。Lv-COPE mRNA在各组织中呈遍在表达,在肌肉组织中表达量最高。低温表达谱分析显示,LvCOPE mR...
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