采用根癌农杆菌感染半夏无菌叶片、叶柄和愈伤组织,对GUS基因的瞬间表达进行研究,并分析了不同转化受体、感染时间、菌液浓度、共培养、预培养时间、菌种对GUS基因的瞬间表达的影响。结果显示,以半夏的无菌苗叶柄和愈伤组织,在OD值为0.2的EHA101或EHA105农杆菌液中感染15 min,叶柄暗处共培养3 d,愈伤组织2 d,能够得到较高的GUS基因瞬间表达。

以GFP为报告基因构建植物表达载体pCB302-3-GFP,采用农杆菌叶片注射法对其在本氏烟叶片中瞬时表达条件进行优化。分析基因沉默抑制子p19、菌液不同浓度以及侵染时间对GFP荧光强度的影响,结果显示,当农杆菌菌液D600为0.8~1.0并与含有p19基因的载体共注射条件下,农杆菌注射3~5d后本氏烟草叶片表现出很强的绿色荧光,实现了GFP在本氏烟草中的高效瞬时表达。

以GFP为报告基因构建植物表达载体pCB302-3-GFP，采用农杆菌叶片注射法对其在本氏烟叶片中瞬时表达条件进行优化。分析基因沉默抑制子p19、菌液不同浓度以及侵染时间对GFP荧光强度的影响，结果显示，当农杆菌菌液D600 0.8~1.0并与含有p19基因的载体共注射条件下，农杆菌注射3~5 d后本氏烟草叶片表现出很强的绿色荧光，实现了GFP在本氏烟草中的高效瞬时表达。

【目的】克隆桑树肌动蛋白MaACT3的启动子。【方法】采用抑制PCR技术获得肌动蛋白的5′端侧翼序列;采用农杆菌感染成熟叶片瞬时表达检测启动子活性。【结果】获得的5′端侧翼序列含有基因的翻译起始位点、第一外显子、第一内含子和第二外显子的一部分,外显子部分与已报道的桑树肌动蛋白MaACT3序列完全相同。通过荧光显微镜观察到了绿色荧光,在mRNA水平上也检测到表达,证实了获得的5′端序列具有启动活性。【结论】获得的桑树肌动蛋白MaACT3的启动子具有启动活性,可以应用于桑树转基因研究。

利用生长素响应原件(DR5)构建了DR5::GUS报告基因表达载体,并在载体构建时,对GUS的5′UTR序列进行2种设计:一种是利用载体GUS基因原有的5′UTR构建成pBI121-DR5::GUS;另一种采用植物增强表达的常用原件烟草花叶病毒(TMV)的5′端序列(Ω′)替换GUS基因原有的5′UTR序列,构建成pBI121-DR5(Ω′)::GUS。将2种载体转化根癌农杆菌后,采用烟草叶片注射浸染的瞬时表达检测法对2个载体的植物表达效果进行检测,2种载体分别转化烟草叶片2 d后,对浸染的叶盘进行GUS染色分析,pBI121-DR5::GUS的转化叶片有明显的GUS反应,而pBI121-DR...

设计了一个顺式元件功能检测载体pYF3553,该载体以GUS为报告基因,其上游连接一段由待测香菇(Lentinula edodes)克隆片段与酵母Cyc1基本启动子组成的杂合启动子。将编号为XG108和XG111的香菇克隆序列构建的检测载体命名为pXG108p、XG111。将pXG108转化到香菇原生质体中,结果被测样的GUS瞬时活性比对照增加一倍,表明GUS基因得到了表达,其上游调控元件具有调控功能。对比pXG108和pXG111转化后的表达结果,其GUS瞬时表达活性表现出差异,这种差异与克隆片段在酵母中的表达差异相一致。分析了利用GUS瞬时表达验证未知香菇顺式元件的优缺点。

【目的】建立农杆菌介导的瞬时沉默小麦HCP1的方法,为简便、快速、高效地研究小麦基因功能提供一种可靠的技术支持。研究HCP1在叶锈菌侵染过程中对H2O2的清除作用,为阐明小麦抗叶锈菌侵染中信号转导机制奠定理论基础。【方法】采用农杆菌注射法,将携带有pe GFP载体的农杆菌注射到小麦叶片中,观察叶片中荧光强度及分布,分析外源质粒在小麦叶片中的表达情况。通过注射EHA105、LBA4404和C58C1 3种不同的农杆菌菌株,将HCP1的RNAi载体导入小麦叶片细胞中,利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测HCP1瞬时沉默效率,并结合Rohringer染色分析,明确不同农杆菌对寄主叶片侵染能...

【目的】医学方面的大量研究证实,聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)作为一种新型阳离子多聚物基因载体可以吸附和浓缩DNA,通过与细胞膜亲和粘附和细胞吞噬作用运载外源基因进入细胞并实现表达。本实验研究旨在探索PEI作为非病毒基因载体介导外源基因进入植物细胞并获得瞬时表达的可能性。【方法】制备PEI/DNA复合物,利用凝胶阻滞分析PEI与DNA的结合情况,采用电子显微镜观察PEI/DNA复合物的形态。以绿色荧光蛋白基因为报告基因研究不同N/P比条件下PEI/DNA复合物对拟南芥原生质体细胞的转化效率,并与PEG转化方法进行比较分析。【结果】PEI与DNA的质量比为5﹕1～1﹕4,...

以贵州珍珠半夏Pinellia ternate(Thunb.)Breit为材料,采用根癌农杆菌介导法,探索了影响半夏遗传转化效率的主要因子。结果表明,卡那霉素的最佳筛选浓度是100 mg/L,侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度对转化频率都有一定的影响。其中侵染时间为20 min,共培养时间为3 d,乙酰丁香酮的浓度控制在60~100 mg/L时可以有效提高遗传转化效率。在此基础上辅以超声波处理5 min,可以有效提高叶柄转化的瞬时表达率。对抗性转化植株进行Gus染色和PCR检测,结果表明外源基因ipt已经整合到半夏基因组中。

休眠是植物适应季节气候变化的一种生长调节机制。近年来由于全球气候变化使得休眠的遗传机制研究迫在眉睫。与梅花休眠相关的MADS-box基因被认为是调控梅花休眠规律的遗传因子。然而,通过同源植物的转基因来研究这类基因的功能尚未有报道。最近,Gao等(2010)成功地开发了梅花的遗传转化系统。本文试图用农杆菌介导转化未成熟子叶,通过PmDAM6的组成型表达或RNAi诱导基因沉默的方法来控制PmDAM基因表达。尽管体细胞胚胎发生率很高以及转化率也能够接受,但从体细胞胚很难获得再生植物。最终,我们只得到了少数转基因个体。初步的表达分析表明该系统能够控制PmDAM基因的表达。因此,为了进一步鉴定PmDAM...

[目的]本研究克隆了水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)CUC1基因,分析其表达特性,为该基因在水曲柳再生的调控研究中奠定基础。[方法]从水曲柳苗克隆FmCUC1基因,利用生物信息学软件分析FmCUC1基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列,并构建系统进化树;利用农杆菌介导法将FmCUC1基因转入洋葱内表皮细胞进行亚细胞定位,通过实时荧光定量分析FmCUC1基因在根、茎、叶、顶芽的组织表达特异性及FmCUC1基因在下胚轴芽再生与种子萌发过程中的差异表达;同时对水曲柳幼苗喷施IAA、6-BA、BR激素处理,分析FmCUC1基因在不同激素信号诱导下的表达模式;利用农杆菌介导法将FmCUC1基因瞬时转化水曲柳72 h后,分析其通路相关基因表达情况。[结果]克隆得到FmCUC1基因全长807 bp,编码269个氨基酸,FmCUC1为稳定疏水蛋白,含有保守的NAC-domain蛋白结构域;FmCUC1蛋白与同科的木犀榄蛋白序列相似性为86.17%,亲缘关系较近;FmCUC1蛋白定位于细胞核上。qRT-PCR分析表明:FmCUC1基因在水曲柳的顶芽中表达量最高;在下胚轴芽再生过程中,FmCUC1基因在芽点产生与丛枝形成期均高表达;在水曲柳种子萌发过程中,FmCUC1基因分别在第4天和第8天分别达到两个峰值,为第0天的8.56倍和8.46倍。外源喷施IAA、6-BA、BR激素处理结果显示,FmCUC1基因表达量与对照相比均呈现上调表达,在IAA、BR处理72 h后均达到最高值,分别为对照的45.72倍和20.36倍;在6-BA处理48 h达到峰值,为对照59.40倍。利用农杆菌介导水曲柳FmCUC1基因瞬时过表达72 h后,该基因表达量显著上调,且其下游STM基因的表达量也明显上升。[结论]FmCUC1基因属于NAC家族转录因子,参与水曲柳芽再生过程,响应了IAA、6-BA、BR植物激素信号诱导,过表达FmCUC1基因可激活其下游STM基因的表达,进而有利于顶端分生组织的形成;为进一步研究CUC1基因在水曲柳芽再生过程中的作用机制奠定基础,也为今后水曲柳转基因工作提供新思路。

用高压氦气式基因枪将CaMV35S启动子驱动下的gus基因导入经济植物番红花的叶鞘和叶、芽来源的愈伤组织块中 ,4 8h后染色检测到了gus基因的瞬间表达 ,2 0d后仍检测到极少量表达 .研究发现 ,轰击前在加有 0 5mol L甘露醇的液体愈伤组织继代培养基上处理 6h ,明显增加了gus基因表达的数量 ;选择 110 0psi× 9cm的轰击条件 ,转化效果最好 ;高浓度卡那霉素 (5 0 0～ 80 0mg L)可以作为筛选剂 .结果表明 ,基因枪法是有效的番红花遗传转化方法 ,gus基因可以作为番红花基因工程研究的报告基因 ,CaMV35S启动子能有效驱动外源基因在番红花组织中表达

基因瞬时表达是研究目标基因功能的快速、有效手段，在植物领域得到了广泛应用。为了使学生充分了解基因工程技术在植物次级代谢物研究中的应用，实现科研反哺教学，设计了植物基因瞬时表达并影响其次级代谢物质积累的综合实验。选取非模式植物莲（Nelumbo nucifera）转录因子NnWRKY70和NnMYB5为研究对象，运用分子克隆技术构建双元表达载体。利用农杆菌注射法将目标基因导入莲花瓣中实现瞬时转化，发现过表达NnWRKY70和Nn MYB5能促进莲生物碱的合成以及花瓣花青素的积累。该实验是对以往植物生物学及生理学实验内容的扩充，有利于培养和提高学生的科研思维和实践创新能力。

通过挖掘辣椒疫霉中的外泌蛋白激发子elicitins的基因序列,分析其转录特征,克隆基因序列并进行瞬时表达,以阐明其在辣椒疫霉生长发育和侵染过程中的作用。本研究利用转录组测序结果和致病疫霉INF1序列作为比对序列,对辣椒疫霉基因组数据库进行elicitins序列挖掘。采用RT-PCR方法分析elicitins基因在辣椒疫霉生长发育(菌丝、游动孢子囊、游动孢子、萌发的休止孢)和侵染寄主阶段(本氏烟灌根1.5、3、6、12、24、36和72 h后)的转录水平。克隆elicitins基因序列,并与其他卵菌的elicitins进行序列比对,分析进化关系。在本氏烟上进行elicitins的瞬时表达分析。...

根据GenBank中植物病原物诱导型启动子碱基序列设计引物,以烟草基因组DNA为模板,扩增PPP3启动子。用PPP3替换pCAMBIA1301中与gus基因相连的35S启动子,构建重组质粒pCOMBIA+PPP3+gus后导入农杆菌GV3101。通过农杆菌介导的瞬时表达技术将受PPPs控制的gus基因导入烟草。分别接种青枯菌和水杨酸24 h后,烟草叶片中检测到gus基因转录效率分别提高了27.94,17.69倍。表明PPP3启动子具有本底表达水平低、诱导表达活性强的特点。