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[期刊] 中国水产科学
[作者]
邱丽华 冯娟 江世贵 张汉华 宋林生
采用同源克隆和锚定PCR技术,从军曹鱼(RachycentroncanadiumLinnaeus)中克隆到白细胞介素1β(interleukin 1β)基因cDNA的全序列。军曹鱼IL 1β的cDNA全长1104bp,3′非编码区域(UTR)为255bp,5′UTR为108bp,开放阅读框(ORF)为741bp,编码246个氨基酸,分子量大约为27 68kD,理论等电点为5 71。同源性分析表明,该序列与其他鱼类甚至哺乳动物的IL 1β基因具有很高的相似性,并含有白细胞介素家族的签名序列(signature)。同时,利用RT PCR技术,对特异性病原刺激下该基因在鱼体内的表达情况进行初步研究,...
[期刊] 水产学报
[作者]
李兰 高阿龙 陈建林 雷阳 吴丽婷 叶剑敏
为研究白细胞介素21（IL-21）及其受体IL-21R在鱼类抵御病原菌的免疫应答过程中的作用及在机体炎症中的分子机制，实验利用反转录PCR（RT-PCR）技术成功克隆了尼罗罗非鱼IL-21基因（OnIL-21）及其受体IL-21R基因（OnIL-21R），对其进行生物信息学分析，并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测其mRNA水平的表达。结果显示，OnIL-21及其受体OnIL-21R的开放阅读框为420 bp和1 548 bp，分别编码139和515个氨基酸。经氨基酸序列预测分析，OnIL-21为分泌型蛋白，具有多个保守的磷酸化位点和一个Ig-like结构域；而OnIL-21R是跨膜蛋白，具有典型的γ-c链，氨基酸序列都具有多个保守的磷酸化位点和糖基化位点。系统进化树结果表明，IL-21与其受体IL-21R的氨基酸序列在物种进化过程中具有一定的保守性，尼罗罗非鱼IL-21和IL-21R的氨基酸序列均与斑马拟丽鱼IL-21和IL-21R的亲缘关系最近。组织差异性表达分析发现，OnIL-21及OnIL-21R在健康罗非鱼的多种组织中均有表达，但具有明显的组织差异性。OnIL-21在皮肤和心脏组织中表达量较高，在肌肉中较低；而OnIL-21R在鳃和脾脏组织中表达量最高，在肌肉中最低。无乳链球菌和嗜水气单胞菌体内感染和体外刺激白细胞后，头肾和脾脏中OnIL-21和OnIL-21R表达量均呈现显著上调，并在72 h内维持较高水平的表达，说明OnIL-21和OnIL-21R可能参与尼罗罗非鱼病原菌感染的免疫应答过程。此外，重组蛋白(r)OnIL-21刺激脾脏白细胞后，OnIL-21R和炎症相关因子基因（IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10）的表达均发生显著上调，表明OnIL-21可调控其受体基因OnIL-21R的表达及参与调控机体的炎症反应。上述研究结果阐述了尼罗罗非鱼IL-21与其受体IL-21R的分子生物学特征，并初步阐明了二者参与了机体病原菌感染的免疫应答过程，为进一步探究IL-21通过其受体IL-21R调控机体免疫反应的作用机制和信号通路提供了重要参考。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
陈吉刚 杜海韬 熊娟 毛芝娟 杨季芳
采用RT-PCR方法扩增和克隆了鲈鱼白细胞介素-8(LjIL-8)的编码阅读框。该编码阅读框由300个核苷酸组成,编码由99个氨基酸组成前体蛋白。LjIL-8氨基酸序列与哺乳动物和鱼类IL-8类似物的氨基酸同源性分别为23%～48%和25%～92%。氨基酸序列分析表明,N端存在一长23个氨基酸的信号肽,含有形成2个链内二硫键的4个半胱氨酸。分子进化分析表明,LjIL-8与欧洲鲈鱼的亲缘关系最近。将LjIL-8编码序列克隆到原核表达载体pET-28a(+),转化E.coli BL21(DE3)后用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE检测结果表明,预期分子量大小的小分子蛋白在大肠杆菌中成功表达,...
关键词：
鲈鱼 白细胞介素-8 克隆 原核表达
[期刊] 水产学报
[作者]
李明云 苗亮 郭晓飞 聂力 侯红红 陈炯
为了解香鱼白细胞介素17(interleukin 17,IL-17)的序列特征、系统发育及其与鳗利斯顿氏菌侵染的相关性,实验采用RACE-PCR方法扩增出香鱼IL-17C基因c DNA序列,并通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了鳗利斯顿氏菌侵染后香鱼各组织中IL-17C基因的表达变化。结果显示,香鱼IL-17C基因c DNA序列全长1 087 bp,含534 bp的开放阅读框,在3′端非编码区存在7个m RNA不稳定信号(ATTTA)。预测该基因编码177个氨基酸,N端19个氨基酸为信号肽
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘钦松 张丛丛 刘孟刚 许彤
构建人源白介素(h-IL2)基因的表达载体,并尝试在原核细胞中诱导表达,以用于进一步重组蛋白纯化和抗体生产。以h-IL2基因为模板,采用PCR技术扩增h-IL2基因,连接到pMD-18T载体中构建克隆载体,转化到感受态DH5α,提取质粒PCR、双酶切验证连接成功,经DNA测序鉴定基因序列与GenBank数据库收录h-IL2基因(NM_000586.3)序列一致;再将h-IL2基因插入到pGEX-4T-1构建表达载体,转化至感受态BL21(DE3),筛选阳性克隆IPTG诱导。SDS-PAGE验证成功表达融合蛋白GST-IL2。
关键词：
白细胞介素 基因克隆 原核表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
邱丽华 江世贵 张汉华 杨铿 周发林
采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)的方法,从经LPS刺激的花鲈(Lateolabrax japonicus)总RNA反转录产物中获得了803 bp的IL-8 cDNA序列。该序列包含159 bp的5′非编码区(UTR)和359 bp的3′非编码区(UTR)以及297 bp的开放阅读框(ORF),可编码99个氨基酸。序列的3′UTR含2个mRNA不稳定基序,在Poly A尾上游17 bp处有1个明确的Poly A加尾信号(AATAA)。预测的氨基酸结构含27个氨基酸组成的信号肽,将信号肽切除可产生72个氨基酸组成的成熟肽,预测成熟肽的分子量约为8.3 kD,等电点为7.85。花鲈IL-8序列...
关键词：
花鲈 白细胞介素8 克隆 序列分析
[期刊] 水产学报
[作者]
李健 孟繁星 黎明 王日昕 石戈
实验从大弹涂鱼皮肤组织转录组中筛选出大弹涂鱼IL-8基因,并分析了其序列特征,构建了系统发生树,评估了IL-8基因在健康个体不同组织中的表达差异,以及在不同病原体刺激下IL-8基因在机体主要免疫器官肝脏和脾脏中的表达情况。结果显示,该基因的开放阅读框由306个碱基组成,编码101个氨基酸残基,包含典型的由18个氨基酸残基组成的信号肽,和1个由62个氨基酸残基组成的SCY结构域,该结构域还包含了4个保守的半胱氨酸残基,分别为Cys-30、Cys-32、Cys-57和Cys-73。大弹涂鱼IL-8氨基酸序列中的受体结合位点基序ELR (Glu-Leu-Arg)被Asn-Ser-His (NSH)取代,系统进化分析表明,纯化选择影响了鱼类该基序的多样性,且IL-8基因在大弹涂鱼乃至硬骨鱼中不可取代。荧光定量实验结果显示,IL-8基因在大弹涂鱼的健康组织中广泛表达,在鳃和脑中表达量最高。细菌和poly(I∶C)注射实验表明,在受到感染后,肝、脾和脑组织中IL-8的表达量均上调,说明IL-8基因在大弹涂鱼肝、脾和脑组织的炎性反应和免疫应答中起到了重要作用,为大弹涂鱼免疫基因的后续研究提供了参考。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王彦彬 卢中华 康相涛 宋素芳 孙桂荣 韩瑞丽 李国喜 李守义
参照GenBank上已发表的鸡白细胞介素2序列设计引物,运用RT-PCR技术,从经ConA诱导的 20～35日龄固始鸡脾细胞总RNA中扩增出目的片段,IL-2基因,将其插入到pGEM-T载体上,构建了克隆质粒 pGEM-T-chIL-2。测序结果表明,本试验克隆的固始鸡白细胞介素2基因与GenBank上已发表的序列相比,存在2 个核苷酸变异。重新设计表达引物,以克隆质粒pGEM-T—chIL一2为模板PCR扩增表达片段,对表达片段进行 Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切,连接到作同样双酶切的pET28a表达载体上,鉴定后转化大肠杆菌BL21并进行IPTG 诱导表达,然后对表达产物进行SDS-PA...
关键词：
固始鸡 白细胞介素2 原核表达 生物活性
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
陈红英 崔保安 金钺 贾艳艳 刘金朋 段志刚
根据GenBank发表的鸡IL-18cDNA基因序列,自行设计1对引物,应用RT-PCR技术,无需用非特异性免疫原如ConA,PHA等刺激分离的脾淋巴细胞,直接提取总RNA,扩增固始鸡IL-18基因,并进行克隆和测序.测序结果:获得了固始鸡IL-18基因全序列,其大小为597 bp;序列比较分析发现,克隆的固始鸡IL-18基因与Schneider报道的鸡IL-18基因序列核苷酸同源性为99.8%,有1个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为99.5%;固始鸡与人和其他动物的IL-18基因序列分析和系统进化分析表明,IL-18基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.
关键词：
鸡IL-18基因 克隆 序列分析
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王资生 齐志涛 黄贝 张启焕 仇明 邵荣
根据梭鱼IL-22cDNA序列设计特异性引物,从梭鱼脾脏中扩增IL-22用于表达片段,连接至载体pUC57。分别以BamHⅠ和KpnⅠ对含有目的基因的质粒和pQE-30进行酶切,连接并转化到大肠杆菌M15中,以IPTG进行诱导表达。表达产物通过Ni-NTA亲和层析进行纯化。经SDS-PAGE对表达产物进行鉴定。SDS-PAGE显示该IL-22表达质粒经IPTG诱导后,IL-22重组蛋白主要在菌体培养上清中表达。通过优化蛋白表达及纯化方法,成功获得了梭鱼IL-22活性蛋白。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李祥瑞 金红 卢景良
用哺乳动物细胞表达克隆系统克隆了鸡ＩＬ－２ｃＤＮＡ。以ＣｏｎＡ（２０μｇ／ｍＬ）诱导ＳＰＦ鸡脾脏淋巴细胞，第２０小时收集细胞，提取ｍＲＮＡ，以ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ试剂盒合成ｃＤＮＡ，定向连结于穿梭质粒ｐＳＶ·ＳｐｏｒｔⅠ，构建ｃＤＮＡ文库。将文库分组提取重组质粒，转染ＣＯＳ－７细胞，表达ｃＤＮＡｓ。以淋巴细胞增殖试验检测表达产物ＩＬ－２活性。经过３轮筛选，获得１４个具有ＩＬ－２活性的克隆。选择其中４个进行酶切分析，结果显示这４个ｃＤＮＡ大小分别为１．５，１．０，０．８和０．８ｋｂ。
关键词：
鸡 白细胞介素-2 cDNA 克隆
[期刊] 中国农业科学
[作者]
闫若潜 谢彩华 吴志明 张志凌 刘光辉 刘梅芬
【目的】研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂以对鸡的病毒性疾病进行防治。【方法】采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头将鸡α干扰素(chicken interferon alpha,ChIFN-α)与鸡白细胞介素2(chicken interleukin-2,ChIL-2)基因构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-T Easy载体,将嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体中进行原核表达。通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rCh...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王淑娟 陈红英 魏战勇 刘金朋 耿静微 崔保安
采用RT-PCR技术自豫南黑猪脾淋巴细胞中扩增猪IL-2基因(pIL-2),RT-PCR产物进行T-A克隆并测序,获得了猪IL-2基因序列。将BamHⅠ酶切的猪IL-2基因非定向克隆到BamHⅠ酶切并去磷酸化的pSY538载体上,通过PCR、酶切和测序鉴定,筛选正向插入的重组质粒pSY538/pIL-2。NotⅠ酶切pSY538/pIL-2后,得到含有双启动子LP2和EP2的猪IL-2基因片段,将其亚克隆到含有LacZ基因的pSY681载体上,筛选正向插入的重组禽痘病毒转移质粒pSY681/pIL-2。测序结果表明,克隆的豫南黑猪IL-2基因长482 bp,包含1个完整读码框(465 bp),...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李瑞 徐海霞 吴伟 王素莹 任梦可 张朋朋 徐永杰
为了研究转化生长因子β激活激酶1(Transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)在猪骨骼肌生长发育中的作用,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得猪TAK1的cDNA全长,并分析其时空表达及真核细胞中的亚细胞定位情况。结果表明,TAK1 cDNA全长2 163 bp(Gen Bank登录号:KU504629),ORF为1 740 bp,编码579个氨基酸,其氨基酸序列与人、恒河猴、绵羊的相似性均为98. 8%,表明该蛋白在不同物种间高度保守。猪TAK1蛋白具有催化丝氨酸/酪氨酸磷酸化的STKc_TAK1结构域,而在该结构域中还有多个保守的ATP结合位点、A-Loop结构域、TAB1(TGF-beta activated kinase 1)结合位点。荧光定量PCR结果显示,TAK1基因在出生后120 d大白猪的免疫器官脾脏中表达量最高,胰腺、背最长肌等组织中的表达量较低;而不同发育时期的背最长肌中,该基因在胚胎期65 d表达量最高,随着生长发育表达量下调;在不同品种间,TAK1基因在各时期大白猪中的表达量均高于梅山猪,除出生后90 d外,其他时期差异均达到显著水平或极显著水平。pcDNA3. 1(+)-EGFP-TAK1重组质粒转染C2C12细胞后的荧光共定位结果显示,TAK1蛋白的表达主要集中在细胞质中。综上,TAK1基因在猪骨骼肌发育过程中起着重要作用,为进一步研究猪TAK1基因的功能奠定了基础。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
赵雅坤 史贤明 张忠明
人白细胞介素4(hIL4)是一种重要的免疫活性调节分子,与一些自身免疫性疾病有重要关系。将hIL4基因融合到衣藻叶绿体rbcL 5-’UTR和3’-UTR之间,组成5’UTR-hIL4-3’UTR片段,将其插入到来源于衣藻叶绿体基因组5.7 kb同源片段中,构建成pXhIL4同源重组质粒。利用电脉冲法将该质粒与含有aadA基因的壮观霉素抗性质粒p228共同转化衣藻叶绿体,从含100μg/mL的壮观霉素抗性平皿上筛选到阳性藻落,并通过PCR方法检测到hIL4基因,其共转化频率高达90%。经过western blotting印迹转移分析,证实了人白细胞介素4基因在衣藻叶绿体中获得成功表达,为进一步...
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