【目的】构建具有较高胱硫醚β-裂解酶活性的葡萄酒酵母工程菌株,用于提高葡萄酒的香气品质。【方法】利用质粒pAUR123将大肠杆菌tnaA基因在中国本土酿酒酵母菌株LFP525中进行表达,得到的转化子进行酶活测定,并通过模拟汁和干白的发酵,评价其酿酒特性和产生硫醇类物质的能力。【结果】成功获得酵母工程菌株TH1和TH2,其胱硫醚β-裂解酶活性与受体菌比提高了32.25%-59.44%。模拟葡萄汁发酵显示,工程菌株中硫醇类物质的产量显著提高,是受体菌的2.8-4.3倍。工程菌株的发酵时间比受体菌略长,残糖和挥发酸显著高于宿主菌,但其含量处于正常范围。在长相思干白发酵试验中,该工程菌株的主要酿酒特性...

　研究了20余种工业化葡萄酒活性干酵母对高温与低温的适应性。结果表明,供试菌株在37℃均生长良好,其中10#-1,10#-2,11#-1,11#-2和21#等5个菌种在供试菌中较耐高温,在45℃仍可生长;在10～16℃培养时,随着温度的降低,菌体生长的速度减慢,其中9#,15#,18#,26#,27#和30#对低温(10℃)的适应性略强;同一菌种个体间在生长速度和生长量上存在差异。

【目的】分离鉴定云南昆明葡萄产区的葡萄酒相关酵母,为该地葡萄酿酒酵母资源的筛选及其利用奠定基础。【方法】以采自昆明官渡区三瓦村的葡萄桨果为材料,将葡萄果皮用灭菌的液体SelMed富集培养基进行培养,经稀释再培养以获得酵母单菌落,采用ITS序列分析和RFLP鉴定分离的相关菌种,并利用微卫星指纹图谱对酿酒酵母的不同菌株进行鉴定。【结果】从云南昆明葡萄产区葡萄果皮上分离获得了207个单克隆菌落。PCR扩增和RFLP分析表明,这些单菌落分属于3个属,分别为梅奇酵母属(Metschnikowia)、红酵母属(Rhodotorula)和酿酒酵母属(Saccharomyces),其中梅奇酵母属出现频率最高,...

利用WL营养琼脂培养基,对葡萄酒自然发酵过程中,不同阶段分离的408株酵母菌进行了初步鉴定。结果表明,供试酵母菌被归入8个属的9个种:酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、葡萄汁有孢汉逊酵母Hanseniaspora uvarum、季也蒙有孢汉逊酵母Hanseniaspora guilliermondii、东方伊萨酵母Issatchenkia orientalis、毕赤克鲁维酵母Pichia kluyver、膜璞毕赤酵母Pichia membranefaciens、美极梅奇酵母Metschnikowia pulcherrima、红冬孢酵母Rhodosporidium muc...

【目的】研究SO2和酒精处理对葡萄酒自然发酵醪液中酵母菌群数量和种类的影响。【方法】分别对葡萄酒自然发酵醪液进行60,80,100 mg/L SO2处理和体积分数5%,10%,15%酒精处理,并分离不同发酵时期葡萄醪液中的酵母菌。应用5.8S-ITS扩增片段的RFLP分析检测技术,结合WL营养琼脂培养基上的菌落形态及颜色,对分离的酵母菌进行鉴定。【结果】无论是SO2处理还是酒精处理,发酵后期优势菌群主要为酿酒酵母;SO2处理主要对SO2敏感的酵母菌群影响较大,同时酵母菌群还受发酵产物酒精的影响,发酵中后期除酿酒酵母外只能分离到少量耐SO2的拜耳接合酵母和贝酵母;酒精处理中,发酵初期主要分离到的...

葡萄皮上天然存在着非酿酒酵母属酵母（non-Saccharomyces），主要在葡萄酒浸渍和发酵初期发挥作用，近年来非酿酒酵母属酵母在葡萄酒发酵中的应用受到越来越多的关注。相对于酿酒酵母，非酿酒酵母属酵母在酒精发酵中具有较弱的发酵力，可将还原糖转化为乙醇及其他代谢副产物，是生产复杂风味和低酒度葡萄酒的潜在优良酵母。不同非酿酒酵母属酵母菌种在葡萄酒发酵应用中具有不同的代谢特征，选择具有一定特征的优良非酿酒酵母属酵母应用于发酵中，可以提高葡萄酒的特色化品质。本研究在总结商业化非酿酒酵母属酵母的种类、酿造特点和应用方式的基础上，重点综述了不同非酿酒酵母属酵母对葡萄酒颜色、香气、口感和安全健康4个方面的积极作用、代谢机理和研究热点：具有高产酸、多糖、胞外丙酮酸及低吸附性等特性的非酿酒酵母属酵母可通过不同代谢机理促进葡萄酒颜色的稳定；不同非酿酒酵母属酵母通过低产乙醇、乙醛、降低挥发性酚类，高产乙酸乙酯、乙酸酯类化合物、乙酯类化合物、高级醇、与萜烯或硫醇释放相关的酶类等途径促进葡萄酒果味香气的提升，增加香气复杂性；非酿酒酵母属酵母通过高产甘油、多糖和乳酸，降解苹果酸等方式调节葡萄酒的口感特征；非酿酒酵母属酵母作为生物防治剂可以降低葡萄酒酿造中二氧化硫的用量，通过代谢降解作用减少有毒化合物，提升葡萄酒的安全质量。本文进一步解析了非酿酒酵母属酵母的基因组和微卫星位点分析研究现状，探讨了目前非酿酒酵母属酵母葡萄酒发酵应用研究的主要接种策略，提出了未来研究仍需关注的热点方向，为非酿酒酵母属酵母在葡萄酒酒精发酵中的应用研究提供理论参考。

为探索本土野生酵母在刺葡萄酒酿造生产中的应用价值,改良刺葡萄酒品质,采用顶空固相微萃取(HS–SPME)和气相色谱-质谱联用(GC–MS)技术对1株商业酿酒酵母和6株野生酿酒酵母所酿刺葡萄酒的挥发性物质进行分析,并用统计建模软件RGui构建热图,分析各菌株对刺葡萄酒香气的影响。结果表明:刺葡萄酒中的挥发性物质主要为酯类物质,其次是醇类物质;LE28、LD22与商业酵母RC212处于同一分支,其刺葡萄酒呈香物质含量趋势一致;LD1015独成一支,其香气物质总含量显著高于其他菌株的,但含有闻起来令人不愉快的气

【目的】克隆绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因,并在粟酒裂殖酵母细胞中进行表达分析。【方法】利用PCR技术,从绿色木霉中克隆纤维素酶β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,再通过XhoⅠ和NotⅠ2个酶切位点与粟酒裂殖酵母表达载体pREP5N连接,构建酵母真核表达载体,利用电转化方法转化粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞,并在SP-Q01中进行表达分析,最后采用DNS法测定表达产物的酶学活性。【结果】PCR扩增得到2 380bp的bglⅠ基因序列,包括完整的CDS序列和信号肽序列,编码序列与已报道的里氏木霉纤维素酶基因序列相似性为100%;对酵母转化子进行诱导培养后,SDS-PAGE电泳检测得到大小...

考察了半胱氨酸(CYS)添加量和添加时间对酿酒酵母(Saccharomy cerevisiae Y08)合成谷胱甘肽(GSH)的影响。结果表明:在发酵开始时添加半胱氨酸,能够增强菌体合成GSH能力,当添加量达到0.05%时,GSH产量达到最大值(52.28mg·L-1)。在发酵稳定期(10h)添加半胱氨酸,胞内GSH含量增加不显著,GSH产量仅提高了10.57%。为降低半胱氨酸对菌体生长的抑制,对酿酒酵母原生质体进行复合诱变,筛选半胱氨酸抗性突变菌株。结果表明:半胱氨酸对半胱氨酸抗性突变菌株的生长抑制作用减轻,抗性菌株能够在含有0.4%半胱氨酸的发酵液中正常生长,GSH产量和胞内GSH含量比未...

【目的】研究优选发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)混合发酵对‘爱格丽’(Ecolly)干白葡萄酒的增香作用,优化干白葡萄酒的酿造工艺。【方法】将发酵毕赤酵母菌株H5Y-28与酿酒酵母菌株F5以10﹕1、4﹕1、1﹕1、1﹕4、1﹕10比例接种,进行模拟葡萄汁的混合发酵,并以酿酒酵母纯发酵为对照,发酵过程中监测酵母的活菌数、总菌数,建立菌体生长动力学模型。按相同接种比例进行爱格丽干白葡萄酒的发酵应用,以酿酒酵母纯发酵和添加发酵毕赤酵母胞外酶处理作为对照,酿造次年4月,对所酿葡萄酒酒样进行香气的感官分析和GC-MS分析。【结果】菌体生长动力学表明,随着发酵毕赤酵母接种比例的升高,其存活数量和存活时间明显增加,但优选菌株H5Y-28的高比例(10﹕1、4﹕1)接种处理会降低酿酒酵母的最大生长数量。感官分析结果表明,混合发酵有利于增强‘爱格丽’葡萄酒的果香和花香,尤其是热带水果香气,但高发酵毕赤酵母接种比例(10﹕1)会给葡萄酒带来较强的生青味,而酒样1﹕1、4﹕1仅引入较弱的生青味。挥发性香气成分分析结果表明,品种香气成分的含量随着发酵毕赤酵母接种比例的升高而增加,尤其是萜烯类和C13-去甲类异戊二烯化合物。此外,添加胞外酶能显著提高葡萄酒品种香气的含量,尤其是C13-去甲类异戊二烯化合物的含量(高于纯酿酒酵母发酵酒样90%)。混合发酵显著增加了酒样中发酵香气中的乙酸酯、C6—C12脂肪酸及其酯类、异戊醇与苯乙醇的含量。与单一酿酒酵母发酵酒样相比,1﹕1接种比例有助于提高酒样中26%品种香气成分和39%发酵香气成分的含量,尤其是显著地提高了中链脂肪酸乙酯的含量(40%)。【结论】毕赤酵母与酿酒酵母1﹕1接种处理不影响酿酒酵母生长,且具有较强的增香酿造潜力。

【目的】研究酿酒酵母多糖对葡萄酒果香酯类物质水解呈香的表观基质效应，探究酿酒酵母多糖在稳定产品果香、延长货架期方面的应用潜力。【方法】以酿酒酵母为材料，利用热水浸提法、碱法提取得到酵母多糖，并通过紫外分光光度计、气相色谱以及高效液相色谱解析酿酒酵母多糖的基本组分。配置含有果香酯类物质常规浓度的模拟葡萄酒溶液，并作酵母多糖处理，多糖浓度在0—2.0 g·L~(-1)范围作梯度设置。酵母多糖对果香酯类物质挥发性的影响采用静态顶空方法分析，随后不同处理模拟酒在4℃下贮藏6个月，定期取样监测果香酯类物质的含量变化。最后通过感官分析评价6个月后不同处理模拟酒的香气特征。【结果】通过仪器分析得到酿酒酵母多糖总多糖含量占比为（72.61±3.29）%，蛋白质含量占比为（11.20±0.02）%，其主要单糖组成为甘露糖和葡萄糖，二者的摩尔比1.790∶1；该多糖的高分子量组分为18、163和21 819 kD，低分子量组分为576 Da。静态顶空分析方法表明，多糖处理可以降低模拟酒中乙酸酯的挥发性，以0.8 g·L~(-1)的多糖处理效果最好；而多糖处理可以提高模拟酒中乙醇酯的挥发性。定期采样数据结果发现，在模拟葡萄酒贮藏6个月期间，乙醇酯的水解速率显著高于乙酸酯；相比于对照组，0.4—0.8 g·L~(-1)多糖处理可以分别将乙酸酯和乙醇酯的水解率降低10%—40%和3.7%—26.7%。感官分析结果显示，在贮藏6个月后，多糖处理的模拟酒中温带酸果、温带甜果、蜜饯类和花香香气特征值会显著高于对照组。【结论】经模拟体系研究得出，在葡萄酒贮藏期间添加0.4—0.8 g.L~(-1)酿酒酵母多糖可以减缓果香酯类物质的水解，稳定葡萄酒的果香，对延长产品货架期有潜在的应用价值。

【目的】研究铜离子对葡萄酒酿酒酵母的氧化胁迫作用,为葡萄酒酿造过程的铜离子控制提供依据。【方法】以模拟葡萄汁为酵母培养基,添加CuSO4分别设置0、0.05、0.10、0.20、0.50和1.00 mmol.L-1Cu2+浓度。另外设置0.50 mmol.L-1 H2O2的处理作为氧化胁迫的对比。【结果】铜胁迫下酿酒酵母细胞内超氧阴离子的产生速率和过氧化氢的含量增加。酿酒酵母膜脂过氧化程度加剧,细胞内丙二醛含量随着铜处理浓度的增加而增加。酿酒酵母细胞内超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性在铜胁迫下有不同程度的升高。铜胁迫下谷胱甘肽和甘油在酿酒酵母细胞内大量积累。【结论】铜胁迫刺激酿酒酵母细胞内活性...

将Brevibacillus brevis US575角蛋白酶基因kerUS进行密码子优化,并在毕赤酵母GS115中表达,以提高角蛋白酶产量。结果表明:优化的基因可在毕赤酵母中成功表达,重组角蛋白酶的分子质量约30 ku,最佳反应条件为pH 9.5和60℃,1 mmol/L的Mn~(2+)、Ba~(2+)对角蛋白酶活性有促进作用。此外,重组角蛋白酶易降解干酪素和β角蛋白(羽毛粉),酶促反应最大速度v_(max)=0.019 g/(L·min),K_m=4.64 g/L,比活力=440 U/mg。研究获得的产角蛋白酶重组毕赤酵母具有较好的应用前景。

应用基因重组技术,将从华东葡萄白河-35-1中分离出的长1179 bp芪合酶(stilbene synthase,STS)基因的cDNA片段克隆入大肠杆菌-酵母菌穿梭型诱导表达载体pYES6/CT上,构建重组酵母真核表达质粒pYES6/CT-STS,转化酿酒酵母菌株INVSc1,用Blasticidin(bsd)筛选出阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行5个时间段菌体全蛋白SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果发现,诱导4 h后开始有目标带(48 ku)出现,诱导16 h开始大量且稳定表达。证明目的基因片段可以在酿酒酵母中表达,为后续基因功能的验证奠定了基础。

【目的】利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和非酿酒酵母（Non-Saccharomyces yeasts,NS）混菌发酵可以改善葡萄酒的香气复杂性和浓郁度。深入分析混合发酵剂中酵母细胞之间的接触作用对酒精发酵及代谢产物的调节效应，更好地控制混菌发酵进程。【方法】以预处理的‘赤霞珠’葡萄汁为试材，分别接种戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）及S. cerevisiae进行纯种发酵、混菌发酵和双室发酵，分析其发酵动力学及挥发性香气化合物差异；并探究不同接种时间模式下混菌和双室发酵对‘赤霞珠’葡萄酒酿造学参数和风味品质的影响。【结果】T. delbrueckii菌株纯种发酵组的最终还原糖含量为89.00 g·L-1，不能独立完成酒精发酵；S. cerevisiae在纯种发酵、混菌发酵和双室发酵组中均保持较高的生长活力，能顺利完成酒精发酵；但混菌发酵过程中的酵母细胞间接触显著降低了T. delbrueckii菌株的生存能力。与S.cerevisiae纯种发酵相比，混菌发酵组和双室处理组的乙醇含量均有所降低，pH显著下降，总酸显著增加（P<0.05）；各处理酒样中检测到挥发酸含量均在0.2—0.7 g·L-1。与S. cerevisiae纯种发酵和双室发酵组相比，混菌发酵组的挥发酸及花色苷含量显著降低。气相色谱-质谱联用技术检测结果显示，T. delbrueckii菌株纯种发酵组香气物质含量最低；相比S. cerevisiae纯种发酵组，混菌发酵和双室发酵组的酯类物质含量均显著增加，高级醇和C6化合物含量明显降低。混菌发酵组中乙酸异戊酯、乙酸己酯、己酸乙酯和辛酸乙酯等酯类化合物含量较双室发酵组显著增加，高级醇和苯衍生物含量明显降低。此外，在混菌发酵过程中，S. cerevisiae的接种时间对乙酸异戊酯和乙酸己酯的生成也有显著影响。感官分析结果表明，与S. cerevisiae纯种发酵相比，同时接种（0 h）混菌发酵处理组显著降低葡萄酒中的生青味，酒样呈现较为浓郁的果香和花香味。【结论】在葡萄酒的混菌酒精发酵过程中，酵母细胞间接触不仅降低T. delbrueckii的生存能力，也显著影响‘赤霞珠’葡萄酒的香气特征和感官品质。