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[期刊] 实验技术与管理
[作者]
石晶晶 张毅 陈学军 朱思庆 王陈 李丽琴
建立共表达人μ阿片受体（human μ‐opioid receptor，hMOR，OPRM）与Gq蛋白的CHO-FlpIn稳定细胞模型，并鉴定其药理学功能，可为体外高通量筛选靶向OPRM的药物奠定基础。该研究首先构建重组表达质粒OPRM-pcDNA5/FRT，并进行鉴定；然后通过脂质体转染法将OPRM-pcDNA5/FRT、GqG66Di5-pIRES/puro3和FLP重组酶质粒POG44共转染CHO-FlpIn细胞，经抗性加压和有限稀释法挑取耐药单克隆，采用FLIPR钙信号检测方法筛选阳性克隆株；最后，通过RT-qPCR对细胞中的OPRM和GqG66Di5 mRNA表达水平进行检测，并选用OPRM激动剂DAMGO和抑制剂Naloxone对稳定细胞株的药理学功能进行鉴定。结果显示：经酶切确定了重组质粒的正确构建；通过重组质粒转染、抗生素加压筛选以及钙信号测定获得22个具有活性的克隆细胞株，其中15号细胞株的荧光信号值最高，命名为Gq-OPRM-CHO；与对照组相比，Gq-OPRM-CHO细胞组中OPRM与GqG66Di5基因mRNA水平分别升高约400倍和120倍；在Gq-OPRM1-CHO细胞中，FLIPR钙信号检测激动剂DAMGO的EC_(50)为0.02 ± 0.002μmol/L，抑制剂Naloxone的IC_(50)为0.04 ± 0.003 μmol/L。该研究成功建立了OPRM与GqG66Di5蛋白稳定共表达的细胞模型Gq-OPRM1-CHO，该细胞株具有对OPRM激动剂和拮抗剂特异性反应的药理学功能。
[期刊] 华北农学报
[作者]
苗现伟 席俊 刘玺 张改平 邓瑞广 李清州 张利娜 游雷鸣 刘运超
为建立小鼠IgGFc受体(moFcγRⅡ)稳定表达的哺乳动物细胞系,PCR克隆小鼠moFcγRⅡ片段,构建真核表达载体pcDNAmoFcγRⅡ。转染COS-7细胞后通过G418抗性筛选和连续克隆,获得了在COS-7细胞表面稳定表达FcγRⅡ的真核细胞系。玫瑰花环试验结果显示其阳性率在90%以上。
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨迪 黄玲巍 杨雅雯 乔自林 王家敏
表皮生长因子受体（EGFR）在许多实体肿瘤中过度表达，建立稳定过表达犬EGFR蛋白的MDCK细胞株，有利于为研究犬或人类肿瘤疾病提供良好的细胞模型和研究基础。首先制备目的片段以构建EGFR基因过表达载体，与慢病毒包装载体共同转染至293T细胞中，48 h后提取上清液经纯化获得EGFR基因过表达慢病毒液。将其转染至MDCK细胞中，经嘌呤霉素筛选和单细胞克隆后观察感染效率，RT-qPCR和Western Blot、间接免疫荧光分别检测基因及蛋白的表达，建立EGFR蛋白过表达MDCK细胞株。使用流式细胞仪分别检测过表达及对照细胞株的细胞凋亡和细胞周期。犬EGFR基因位于18号染色体，由编码跨膜糖蛋白的30个外显子组成。经反应体系，PCR产物交换入线性化表达载体，获得了阳性转化子8个，大小为738 bp。所获EGFR基因过表达慢病毒滴度为3.5×108 TU/mL。转染MDCK细胞后在荧光显微镜下观察荧光效果显著，经检测EGFR基因及其蛋白在细胞中的表达量显著升高。间接免疫荧光试验显示，EGFR在细胞中表达明显增强。过表达细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率显著上升，且在G2/M期发生阻滞。成功建立一株稳定的犬EGFR过表达MDCK细胞株，犬EGFR的过表达催化了细胞分裂，使DNA复制加快，同时刺激了细胞凋亡。
关键词：
犬肾细胞系 表皮生长因子受体 慢病毒载体
[期刊] 水产学报
[作者]
杨宁 周素明 王国良 刘顺 李猛
B型清道夫受体是清道夫受体超家族成员,可识别多种配体,在机体脂类转运及免疫防御过程中发挥重要作用。为深入研究三疣梭子蟹B型清道夫受体(Pt-SRB)的功能,本实验在前期工作基础上构建了Pt-SRB胞外结构域原核表达载体,并成功获得了重组蛋白rPt-SRB。利用亲和层析方法获得纯化的rPt-SRB,并将纯化rPt-SRB蛋白免疫大鼠获得抗rPt-SRB重组蛋白免疫抗血清以用于后续研究。SDS-PAGE检测发现,体外诱导表达重组rPt-SRB以包涵体的形式出现在大肠杆菌BL21裂解液的沉淀中,分子量大小约为4
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘文婷 田立宁 聂小妮 梁宗锁 何蔚娟
【目的】探讨转基因苜蓿植株根、茎、叶和体细胞胚中外源GUS的表达情况,为外源蛋白在苜蓿体细胞胚中的积累提供理论依据。【方法】以在加拿大广泛种植的N4.4.2紫花苜蓿品种的叶柄为外植体,进行农杆菌GV3101介导的苜蓿遗传转化,将感染的苜蓿叶柄外植体置于不同的转化培养基中培养,获得了适合于农杆菌介导的转基因苜蓿植株,将其用于转基因体细胞胚的诱导。采用PCR方法筛选阳性株系,并对其进行GUS组织化学染色分析,对转基因植株根、茎、叶和体细胞胚进行荧光定量分析。【结果】以苜蓿叶柄为外植体成功获得11株阳性转基因植物,转化效率为30.6%。GUS荧光定量分析结果表明,体细胞胚中GUS外源蛋白的表达量明显...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
吴怀光 叶伟星 喻子牛 孙明
【目的】摸索提高AiiA蛋白对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力的方法。【方法】苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白是一种胞内蛋白,能降解参与诱导调控多种植物病原菌致病基因表达的N-乙酰高丝氨酸内酯信号分子。本文采用两种方式来提高AiiA蛋白的活性,即利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白在细胞表面表达该蛋白以及利用苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子来提高aiiA基因的表达量。为此构建该蛋白基因与细胞表面S-层蛋白的锚定区结合而成的融合蛋白基因slh-aiiA以及带有基因cry3Aa启动子的融合基因pro3A-aiiA。为了提高表达的稳定性以及去掉重组菌中非苏...
[期刊] 华北农学报
[作者]
于文慧 展西振 丰艳妮 曹荣峰 姜忠玲 李华涛 田文儒
为了构建HSP72慢病毒表达载体,建立稳定表达HSP72的牛乳腺上皮细胞系。以牛HSP72基因序列为模板,设计并合成引物,PCR扩增目的基因,连接到慢病毒表达质粒中,用包装获得的慢病毒感染牛乳腺上皮细胞,经一定浓度的嘌呤霉素筛选,Hochest33342法对细胞核定位,倒置荧光显微镜下观察转染效率,用免疫组化和Western Blot方法验证感染细胞是否稳定表达HSP72。结果显示,携带HSP72基因的慢病毒滴度约为1. 0×109TU/m L;确定嘌呤霉素的最佳筛选浓度为2μg/m L;牛HSP72慢病毒感染细胞表达HSP72,感染的奶牛乳腺上皮细胞在倒置荧光显微镜下可看到绿色荧光,转染效率可达90%以上;免疫组化结果表明,正常细胞和空载体感染细胞,HSP72呈现低表达,转染携带HSP72目的基因载体细胞,HSP72高表达,呈现颜色较深的棕色; Western Blot方法检测证实与正常转染细胞相比,慢病毒空载体转染的奶牛乳腺上皮细胞HSP72表达稍有降低,但无统计学差异,而携带HSP72基因的慢病毒载体转染的细胞HSP72呈现高表达,且差异极显著(P
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨小玲 季静 王罡
将带有目的基因SeNHX1、GFP的酵母表达载体pYES2-SeNHX1、pYES2-GFP、pYES2-SeNHX1-GFP分别导入nhx1酵母缺失型菌株296H,用共聚焦荧光显微镜观察SeNHX1表达蛋白的亚细胞定位;通过菌株在含盐培养基中生长状况研究该蛋白对Na+的解毒功能。结果表明,296H(pYES2-GFP)菌株的绿色荧光弥散于整个细胞质,而296H(pYES2-SeNHX1-GFP)菌株的绿色荧光包围于液泡膜的一圈,因此,SeNHX1蛋白定位于液泡膜;296H(pYES2-GFP)和296H缺陷型菌株在含0.5 mol/L NaCl的培养基中生长受到抑制;带有SeNHX1目的基因...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
常洪雷 梁革梅 王桂荣 于宏坤 吴孔明 郭予元
【目的】将棉铃虫中肠Bt受体蛋白在真核表达系统中成功表达。【方法】用PCR方法分别扩增出对Cry1Ac毒素敏感和抗性棉铃虫的中肠氨肽酶N1(APN1)基因的去信号肽片段,将其克隆至pUC19载体,测定核酸序列后,克隆入Bac-to-Bac表达系统中杆状病毒转移载体pFastBacHTB中多角体基因启动子的下游,筛选出重组质粒pFastBacHTB/APN1并转化大肠杆菌DH10Bac,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组载体Bacmid/APN1。转染粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(Tn-5B1-4),获得含APN1基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Tn细胞后,得...
关键词：
APN 杆状病毒表达载体 Tn 表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李敏 高翔 陈其皎 董剑 赵万春 王明霞
【目的】利用E.coli体外大量高效表达带有1个额外半胱氨酸残基的α-醇溶蛋白,经Ni+-NTA柱纯化获得目标蛋白,通过氧化-还原反应将其整合到基础面粉中,利用粉质仪研究其对面团流变学特性的影响,以确定该基因表达产物的加工品质效应。【方法】根据α-醇溶蛋白基因编码区保守序列设计引物,从小麦品种陕253中克隆到1条含α-醇溶蛋白基因编码区的目的片段,长度为1243bp(GenBank登录号GQ891685),构建了该基因的原核表达载体pET32a-S253-Agli,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中经IPTG诱导表达,对表达的蛋白进行亲和层析及低温冷冻干燥回收、纯化,通过微量掺粉试验,...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
解家松 许婷 刘玮 何中央 吴信忠
采用RT-PCR方法扩增、克隆和鉴定了泥蚶(Tegillarca granosa)的金属硫蛋白(Metallothionein,MT)基因(TgMT)的开放阅读框(ORF)。基于金属硫蛋白氨基酸序列构建的系统进化树表明,泥蚶和魁蚶(Scapharca broughtonii)的亲缘关系最近。利用ORF序列,构建原核重组表达质粒。重组质粒经PCR、酶切鉴定及测序验证后转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导,表达重组蛋白,重组蛋白的分子量约为28.3 kD。可溶性分析表明重组蛋白主要以可溶性形式存在。用His-tag柱亲和纯化重组蛋白,并利用重组蛋白制备...
关键词：
泥蚶 金属硫蛋白 原核表达 组织细胞分布
[期刊] 水产学报
[作者]
付保忠 卢强 谭业平 孙晓义 李伟 刘相叶 邓洪宽
采用基因文库筛选方法,克隆了鲤外周血白细胞蛋白酶体激活因子PA28βcDNA,对其序列进行了分析,同时利用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测了不同外界因子刺激下鲤外周血白细胞PA28β的表达情况。结果显示,用DD-RTPCR的方法获得差异显示片段A18,经地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,从0.8×104个重组噬菌体中,经过两轮筛选获得阳性克隆。序列分析表明,该阳性克隆长1175bp,含有一个大小为735bp编码244个氨基酸的完整开放阅读框,为编码鲤鱼蛋白酶体激活因子PA28β的全长cDNA。系统发生分析其与已报道的斑马鱼蛋白酶体...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
温玉玲 王玉俭 吴玲燕 严若峰 徐立新 宋小凯 李祥瑞
目的]本文旨在探讨捻转血矛线虫苏氨酸醛缩酶结构域包含蛋白(TA-1)体外对山羊外周血单个核细胞(PBMC)功能的影响。[方法]根据TA-1基因序列设计引物进行PCR,将所得目的片段克隆到pMD19-T载体进行测序和分析;将该片段亚克隆到pET-32a(+)载体中构建表达质粒pE T-32a/TA-1。重组子用IPTG诱导后用SDS-PAGE观察其表达情况,对重组蛋白(rT A-1)纯化、连续浓度梯度递减的尿素溶液透析复性。从健康山羊采集的血液分离获得的PBMC与rT A-1(10μg·mL(-1))共孵育
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王春生 原璐 宁方勇 吴治昊 朴善花 安铁洙
【目的】通过体细胞核移植为获得皮肤特异表达蜘蛛拖丝蛋白的绵羊奠定基础。【方法】将pcDNA3.1和带有角蛋白结合蛋白启动子质粒pGM-T-KAP6.1分别用BglⅡ和Hin dⅢ双酶切后连接,再与蜘蛛拖丝蛋白基因核心序列4S连接,最后通过酶切与pIRES2-EGFP质粒连接后构建真核表达载体pIRES2-EGFP-4S;将此载体线性化后,采用脂质体法转染绵羊皮肤成纤维细胞,通过G418筛选获得转基因阳性细胞。【结果】筛选得到转pIRES2-EGFP-4S的阳性细胞。对阳性细胞经体外培养后的检测显示:(1)细胞形态(长梭形)、细胞生长曲线(呈S形)、群体倍增时间(随培养时间增加逐渐缩短)和细胞接...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
鲍文蕾 李彬 侯鑫 刘俊娥 郭旭东 王志钢 刘东军
【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164(vascular endothelial growth factor 164,VEGF164)基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV(6.3 kb)。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基...
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