口蹄疫是危害猪牛羊等主要家畜畜种的疫病,可造成巨大的经济损失,引发严重的负面社会影响,被中国政府列在一类动物疫病的首位。中国猪、牛、羊养殖量最大、邻国众多,防控口蹄疫不仅对本国农牧业发展起关键作用,而且对全球口蹄疫防控有重要意义。目前,除一些发达国家消灭了口蹄疫并保持着无疫状态外,口蹄疫仍在众多发展中国家流行或散发。中国周边口蹄疫疫情不断,对中国造成高压威胁,近年流行的O/ME-SA/Pan Asia、O/SEA/Mya-98和A/ASIA/Sea-97病毒均是传入的。从周边流行的病毒、流行的频率和循环的区域位置判断,O/Pan Asia-2、A/Iran-05、Asia1/Sindh-08和...

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)能引起偶蹄动物患一种名为口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）的高度接触性、发热性、急性的传染病。FMD的大规模爆发会导致整个国家或地区的动物和动物相关制品产量降低、贸易受限，造成巨大的经济损失。FMDV持续感染是造成FMDV容易蔓延并难以根除的重要原因。该文综述了FMDV持续感染期间病毒在体内的存在位置与感染特性，并以病毒与宿主细胞、宿主免疫系统之间的相互作用为重点，介绍了持续感染相关机制研究进展，总结了疫情防控相关策略，以期为解决FMDV持续感染问题提供参考。

【目的】为了探讨不同灭活时间及纯化对多型口蹄疫疫苗146 S、总蛋白量、抗原收获量及疫苗效力的影响。【方法】选取OM/Re-A/AF/Asia1 4种不同型的口蹄疫疫苗为研究对象,设定不同灭活时间(8、10、12、14和16 h),对每个时间点疫苗母液中146 S、总蛋白和抗原收获量进行检测和差异性分析;测量纯化前后146 S和总蛋白的变化趋势;测定不同灭活时间及纯化前后疫苗PD50数值进行判定效力。【结果】灭活不同时间点,146 S含量和抗原收获量随着时间先增高后平缓的趋势,146 S在14 h出现平缓

将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因克隆到植物表达质粒pB in438中,构建了植物表达载体pB in-VP 1,通过根癌农杆菌叶盘转化法,将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因导入NC 89烟草基因组中,对经卡那霉素筛选获得的20株抗性植株,进行PCR和RT-PCR检测。结果表明,抗性烟草植株中已整合了VP 1基因。

[目的]验证利用革兰氏阳性增强基质颗粒(GEM)浓缩纯化口蹄疫病毒(FMDV)抗原的可行性。[方法]将含有3个自溶素基序的锚钩蛋白基因(PA)与针对O型口蹄疫病毒特异性纳米抗体基因(VHH)串联克隆入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建原核表达载体p ET-VPA,将其转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3),表达获得融合重组蛋白VPA。先将GEM颗粒与重组蛋白VPA在37℃孵育30 min,离心,取沉淀用适量的FMDV抗原液重悬,再经一步低速离心,获得沉淀即为浓缩纯化的口蹄疫病毒抗原。利用SDS-PA

【目的】O型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）不断变异，易导致现用疫苗与流行毒株的抗原匹配性下降引起免疫效果不佳，疫情零星散发。近年来，O型FMDV中SEA（东南亚）拓扑型流行活跃且不断变异，持续对口蹄疫防疫产生压力。系统解析O型FMDV毒株特异性抗原位点以及不同拓扑型毒株的序列差异，明确抗原变异的关键氨基酸，可为FMD抗原分子设计提供依据，为FMD防控提供指导。【方法】利用10株（SEA拓扑型）毒株特异性牛源单克隆中和抗体，对毒株O/GSLX/2010(O/Mya/98谱系)进行抗体压力筛选逃逸突变株，鉴定这10株抗体所识别表位的关键氨基酸。利用牛源多抗血清样本（32份）与逃逸突变毒株进行病毒交叉中和试验，分析SEA拓扑型毒株的免疫优势表位；通过序列比对分析不同拓扑型毒株在该抗原表位上的差异。利用反向遗传技术将差异性抗原表位引入O型FMDV经典疫苗株O/HN/CHA/93(Cathay拓扑型)，对拯救的点突变毒株测序分析后进行间接免疫荧光试验鉴定，并通过病毒蚀斑测定与一步生长曲线检测病毒的复制动力学。利用SEA拓扑型毒株特异性单克隆中和抗体，通过中和试验分析拯救突变株的抗原性，确定影响病毒抗原性的关键氨基酸，评估毒株特异性位点氨基酸的改变对抗原谱的影响。【结果】SEA拓扑型特异性抗原表位主要集中于结构蛋白VP1的B-C/C-D环，属于抗原位点3。10株抗体中多数抗体（8/10）识别的抗原表位在VP1上，其中有6株单抗（A19、B55、B74、C5、F53和F166）识别的关键氨基酸位于VP1 B-C环（T43、K45）及C-D环（P58），另外2株单抗（B66和F41）识别的关键氨基酸位于VP1 C末端。病毒交叉中和试验结果表明，VP1上43位和VP3上131位氨基酸的改变显著降低了牛源多抗血清的抗体效价。对O型FMDV不同谱系毒株（26株）序列进行分析，发现三种拓扑型毒株VP1 B-C/C-D环的28、47、56和58位氨基酸不同。利用反向遗传技术成功将毒株特异性抗原表位引入Cathay拓扑型毒株（O/HN/CHA/93），拯救出6株FMDV的点突变株：POZ-GSLX-M58、POZ-GSLX-M56/58、POZ-GSLX-M28/58、POZ-GSLX-M47/58、POZ-GSLX-M28/58/47和POZ-GSLX-M47/56/58。微量中和试验结果表明，VP1上56/58位对毒株抗原性起到关键作用；然而，进一步增加28位和47位突变会降低抗体B83的中和作用，影响毒株自身的抗原性。因此，VP1上56和58位氨基酸的改变可以扩展SEA拓扑型特异性中和mAbs对O/HN/CHA/93毒株的中和效力与广度。【结论】O型FMDV结构蛋白VP1上56和58位氨基酸是引起SEA拓扑型毒株抗原变异的关键位点，引入这些抗原决定簇可以拓展FMDV O/HN/CHA/93的抗原谱。研究为FMD防控及疫苗设计提供参考。

以寻求有效DNA疫苗黏膜免疫途径为目的,利用带有负电荷的具有黏膜粘附性多糖-壳聚糖来包裹口蹄疫DNA疫苗pcD-VP1形成纳米级颗粒,用此颗粒经滴鼻、口服、直肠和生殖道4种黏膜免疫小鼠,检测小鼠的针对口蹄疫的体液和细胞免疫水平。结果显示:壳聚糖/pcD-VP1滴鼻免疫小鼠,抗体的高峰来临比只免疫pcD-VP1提前2周,直肠免疫处理中也呈现如此效果;经口服和生殖道途径的免疫,均没有呈现比pcD-VP1免疫组更好的抗体水平。但壳聚糖/pcD-VP1在生殖道和直肠免疫途径里均比pcD-VP1免疫组P.P.结的T细胞增殖水平高。所以,除口服途径以外,在滴鼻、直肠和生殖道免疫中,壳聚糖对质粒的包裹均一定...

【目的】研究白细胞介素-10作为黏膜分子佐剂是否可以增强口蹄疫DNA疫苗(pcD-VP1)的黏膜免疫应答。【方法】利用RT-PCR技术以Balb/c小鼠脾脏组织总RNA为模板,扩增出小鼠的IL-10基因,并构建真核表达质粒proVAX-IL-10,通过鼻腔接种方式,将口蹄疫DNA疫苗(pcD-VP1)和真核表达质粒(proVAX-IL-10)共同免疫小鼠,用ELISA法检测免疫小鼠黏膜部位(肺脏、生殖道)sIgA滴度,免疫组织化学法检测气管、生殖道和小肠中sIgA的表达情况,CSFE染色法检测小鼠扁桃体淋巴细胞增殖反应水平,用胞内细胞因子染色法通过流式细胞仪检测扁桃体部位CD4+阳性T细胞内I...

为了研究RHDV病毒样粒子作为载体提呈外源B细胞表位的能力,以兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60为载体,构建携带FMDV B细胞表位(FMDV VP1 B细胞表位200~213aa)的VP60嵌合蛋白,研究外源基因对VP60蛋白的表达、病毒样颗粒(VLPs)的装配及免疫原性的影响。分别在RHDV衣壳蛋白的C端、N端、306和307位氨基酸之间插入外源B细胞表位(FMDV VP1 B细胞表位200~213aa),得到嵌合VP60基因。利用杆状病毒表达系统表达嵌合蛋白,分别命名为VP60-2F、VP60-306F和VP60-578F。经IFA、SDS-PAGE和Western Blot方法鉴...

分析了FMDV各血清型病毒基因编码起始区与终止区的密码子使用偏性。结果表明,FMDV各血清型中的稀有密码子倾向出现于编码起始区,而终止区附近稀有密码子出现的倾向较弱。这一有趣的现象,可利用"稀有密码子调控假说"来解释为FMDV起始编码区的稀有密码子的使用对其编码区表达具有负调控作用。而终止区附近的这种较弱的倾向性表明,终止区密码子的使用对编码区基因表达的影响可能没有起始区那样强烈。同时说明,"稀有密码子调控假说"不仅适用于细菌,而且也适用于一些病毒基因组。

为了生产一种可以直接口服的口蹄疫疫苗,以胡萝卜(Daucus carota L.var.sativa)无菌幼苗下胚轴诱导的愈伤组织为受体材料,通过农杆菌LBA4404介导的遗传转化,在CaMV双35S启动子的驱动下,将口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)结构蛋白VP1基因的活性肽片段(包括2个141~160位肽和1个200~213位肽的基因片段)导入胡萝卜愈伤组织细胞。经PCR和PCR-Southern杂交等方法鉴定转化苗,确认口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因已整合到胡萝卜染色体中,转化效率达到52%。SDS-PAGE试验结果初步证明,在转化苗总蛋白中有...

将从Genbank中提出的20株O型FMDV的全基因组分割成12个编码区域,即Lab、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。通过方差分析,12个编码序列的相对变异率之间无差异(P>0.05);而这12种编码序列所对应的氨基酸相对突变率之间差异显著(P<0.01)。利用Duncan法对这12种氨基酸序列相对突变率进行多重比较,发现3A蛋白的氨基酸相对突变率比其余11种蛋白的差异都显著(P<0.05);VP2、Lpro的氨基酸相对突变率与VP4、2A、2C、3Cpro、3Dpol之间存在差异(P<0.05);而VP4、2A、2C、3Cpro、3Dpol之间无差异...

【目的】明确口蹄疫病毒基因组的结构特征及其变异与结构、功能的关系以及系统发生关系。【方法】利用DNAstar和Clustalx程序进行184个口蹄疫病毒基因组序列的同源性分析、多重排比。【结果】口蹄疫病毒基因组ORF大小有所差异,范围为6963～7120 nt,编码2320～2339 aa的多聚蛋白。核苷酸和氨基酸序列的同源性,7个不同血清型间>77.6%和>78.3%,本研究发现了可能和生物学功能相关的新的保守和变异区域。【结论】口蹄疫病毒RNA的变异类型丰富和多样性程度较高,自然界存在的毒株可能大于血清学和测序发现的FMDV的毒株数目。

用口蹄疫A型病毒AF/72株的第3代乳鼠组织毒,通过乳鼠继续适应3代后,转适BHK-21细胞,获得该毒株的细胞毒AF/72/MF6/BF12,经测定其TCID50为10-8.0/mL;经RT-PCR获得其VP1基因序列,并与GenBank中的其他6株口蹄疫A型病毒株比对,同源性均大于85%;经无菌检验和外源病毒检验,纯净性达到兽用生物制品标准要求;经间接夹心ELISA测定,OD值均大于0.2,且该毒仅能被口蹄疫A型标准血清中和,具有型特异性;经紫外分光光度法测定其146S含量,均值为189 ng/mL,远大于22 ng/mL的国际标准。综合纯净性检验结果、特异性检验结果和146S含量,确定AF...

【目的】建立口蹄疫病毒(FMDV)感染性分子克隆的体内拯救技术平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】将置于T7启动子下的FMDVAsia1/JS/China/2005株全长cDNA的真核重组质粒pFMDV-A经NotI线化后和表达T7RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,进行病毒体内拯救的研究。【结果】转染细胞盲传第3代48h后出现致细胞病变(CPE),第4代10h出现典型的CPE。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的FMDV,而且存在分子标签,表明构建的FMDV全长cDNA分子克隆在BHK-21细胞内成功包装出FMDV。拯救毒与亲本毒...