为提高实验室病毒核酸检测能力，减少检测人员暴露风险，该研究利用机械臂取代人工操作，整合病毒样本前处理、核酸提取纯化、PCR体系构建、PCR扩增检测4个子系统，并通过优化开盖功能、吸液防堵塞功能及液面追踪功能，实现全流程自动化病毒核酸检测系统稳定运行。优化后，开盖成功率提高至99.13%(P<0.001)，吸液成功率提高至99.31%(P

【目的】经长期对中国国内各省市的规模化鹅场常见病毒性疫病核酸检出率进行调查，发现国内许多规模化鹅场均可同时检出多种病毒核酸，并且这种现象非常普遍，鉴于目前国内关于规模化鹅场多种病毒性疫病核酸同时检出的相关数据较为匮乏，论文旨在了解规模化鹅场多种病毒性疫病核酸同时检出的情况并进行分析，为规模化鹅场病毒性疫病的防控提供理论指导和科学依据。【方法】2021年5—10月，自山东、黑龙江、四川、吉林、广西、河南、安徽、辽宁、河北、贵州、湖南及内蒙古等省市的47个规模化鹅场采集737份病料，对其采用普通PCR及RT-PCR方法进行番鸭呼肠孤病毒（muscovy duck reovirus, MDRV）、鸭呼肠孤病毒（duck reovirus, DRV）、鹅星状病毒(goose astroviruses, GAstV)、禽腺病毒（fowl adenovirus, FAdV）、禽网状内皮增生病毒（reticuloendotheliosis virus, REV）、新城疫病毒（newcastle disease, ND）、鹅细小病毒(goose parvovirus, GPV)、鹅圆环病毒(goose circovirus, GoCV)、鹅出血性多瘤病毒(goose hemorrhagic polyomavirus, GHPV)、坦布苏病毒（tembusu virus, TMUV）及H9亚型禽流感病毒（avian influenza virus H9, H9-AIV）等11种规模化鹅场常见病毒性疫病的检测。每份病料剖取完整的肝脏、脾脏、肺脏及肾脏，利用Trizol法提取总RNA；以总RNA为模板逆转录合成cDNA的一条链，而后以cDNA为模板继续扩增获得完整的cDNA，随后以该cDNA为模板利用番鸭呼肠孤病毒、鸭呼肠孤病毒、鹅星状病毒、禽腺病毒、禽网状内皮增生性病毒、新城疫病毒、鹅细小病毒、鹅圆环病毒、鹅出血性多瘤病毒、坦布苏病毒及H9亚型禽流感病毒的特异性引物，通过普通PCR反应扩增目的片段；所有扩增片段均进行琼脂糖凝胶电泳，对部分阳性样品进行测序；将所获得的测序结果与GenBank上发表的相应病毒基因序列进行比较，应用MEGA 6.0软件中的邻接法（neighbor-joining, NJ）绘制系统发育进化树进行分析。【结果】番鸭呼肠孤病毒、鸭呼肠孤病毒、鹅星状病毒、禽腺病毒、禽网状内皮增生性病毒、新城疫病毒、鹅细小病毒、鹅圆环病毒、鹅出血性多瘤病毒、坦布苏病毒及H9亚型禽流感病毒感染情况检测结果显示，GAstV核酸检出率最高，为58.21%;REV及NDV核酸检出率最低，分别为1.36%及1.50%；鹅群不同程度上均可同时检出多种病毒核酸，尤其以2种或3种病毒核酸同时检出的情况较为普遍，占样品总数的67.44%。两种病毒核酸同时检出率中GAstV与GoCV同时检出所占比例最大，为18.44%;3种病毒核酸同时检出率中MDRV、GAstV及GPV同时检出所占比例最大，为36.28%。【结论】明确了我国规模化鹅场可以同时检测到多种病毒核酸这一特征，这可能是我国规模化鹅场病毒性疫病复杂化和防控难度加大的重要原因之一。

应用异羟基洋地黄毒甙元(digoxigcnin)标记的 DNA 探针,检测了细胞培养物和鸡羽髓中提取的马立克氏病毒(MDV)核酸.结果发现,异羟基洋地黄毒甙元标记的马立克氏病毒血清 I 型(GA 株)核酸的BamHI-L 片段探针,只与马立克氏病毒Ⅰ型核酸发生杂交,而不与Ⅱ型(SB-1)或Ⅲ型(HVT)发生杂交.对36份鸡羽髓病料提取的病毒核酸的杂交检测与琼扩试验相比较,前者阳性率为94.4%,后者仅为86.1%.由此说明,Ⅰ型病毒的核酸探针可用于区别强毒株和 HVT 疫苗毒株,并可作为马立克氏病的临床检测的有效手段.

通过分离纯化白斑综合症病毒 (WSSV)粒子 ,抽提病毒DNA ,用限制性内切酶EcoRⅠ或SalⅠ酶切后 ,克隆入质粒pBluescriptⅡKS中 ,从而建立了WSSV部分基因组文库。估计WSSV基因组DNA在16 5kb以上。将WSSVEcoRⅠ克隆片段标记制备为探针 ,进行Southern杂交、打点杂交和原位杂交 ,其结果证明了克隆片段对WSSV特异 ,并为检测WSSV提供了方法。通过对部分基因组文库序列分析发现 ,WSSV核酸序列与已知杆状病毒核酸序列的同源性低 ,与GenBank中已有病毒核酸序列比较都无较大同源性 ,说明WSSV不属于杆状病毒科 ,目前只能列为未分类的无脊椎动物病...

为了优化猪瘟病毒的RT-nested PCR检测方法,对福建省猪瘟流行情况进行了调查。根据GenBank上发表的猪瘟病毒Shimen株基因序列设计并合成了2对引物,优化了猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的RT-nested PCR检测方法,并对所优化的RT-nested PCR特异性进行了检验。结果表明,该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为1×10-7ng/mL,只有CSFV扩增出了272 bp的目的条带,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)阳...

针对钢铁企业生产过程中物流优化问题，从全流程的角度对其进行了研究，建立了混合整数规划模型，以使钢铁企业的物流成本、库存费用及产能损失最优化。最后以天津钢管集团股份有限公司为例，对模型进行了验证。结果表明，提出的混合整数规划模型是可行有效的，能够为解决实际问题提供一定的参考。

通过试管微嫁接,分别将苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒接种到小金海棠组培苗上,并用PAS-ELISA法检测其带毒率。结果表明:接穗小金海棠苹果褪绿叶斑病毒的带毒率为60.0％,其苹果茎沟病毒带毒率为73.3％,从而证明用此方法可以对组培苗进行快速病毒接种而得到带毒的实验材料。

该文以优系短枝富士为主要试材，采用木本指示植物和间接酶联免疫（ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ）两种方法，对苹果褪绿叶斑病毒（ＣＬＳＶ）、苹果茎沟病毒（ＳＧＶ）和苹果茎痘病毒（ＳＰＶ）进行了检测．试验表明，俄罗斯苹果Ｒ１２７４０－７Ａ、司派２２７和弗吉尼亚小苹果３种指示植物可作为上述３种潜在病毒的鉴定植物．植物生长状况对鉴定结果有重大影响．间接酶联免疫检测速度快，准确度高．该试验所用最佳抗体工作浓度ＣＬＳＶ：第一抗体１／６０００，第二抗体１／２０００；ＳＧＶ：第一抗体１／５０００，第二抗体１／３０００．

为了解决目前巢式PCR法检测牡蛎样品中GⅡ型诺如病毒时存在的非特异性扩增、假阴性等问题，本研究对NCBI数据库中在线获得的所有GⅡ型诺如病毒序列进行系统分析，重新设计出针对GⅡ型诺如病毒检测的通用型巢式PCR引物（NG2OF/NG2OR），并从基因型覆盖度、特异性、灵敏度和实际样品检测的稳定性几个方面对新设计的引物进行评估。结果显示：（1）新引物的特异性好，只对GⅡ型诺如病毒进行有效扩增，且不受牡蛎样品本底的影响。（2）新引物灵敏度高，最低可检测至26.4个拷贝。（3）在对92个牡蛎样品进行检测时，新引物的阳性检出率为28.3%，比经典引物高出7.5%。因此，新建立的GⅡ型诺如病毒巢式PCR检测方法在检测牡蛎样品时特异性更强，灵敏度更高，为牡蛎中诺如病毒的检测提供了一种新的、可靠的技术手段。

在大田生产中,甘薯极易受到甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)和甘薯矮化退绿病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)的混合侵染,导致甘薯产量和品质严重下降,因此构建能同时检测SPFMV和SPCSV两种病毒的检测技术体系对甘薯病毒病(sweet potato virus disease,SPVD)的预防具有重要意义。RT-PCR病毒检测技术具有灵敏度高、特异性强的优点。针对SPFMV和SPCSV病毒分别设计4对和3对特异性引物,通过单一RT-PCR检测技术筛选出特异性强的引物和最佳退火温度;在双重RT-PCR检测体系中,针对SPFMV和SPCSV两种病毒的引物浓度组合设置5个处理,优化双重RT-PCR病毒检测技术体系。单一RT-PCR检测结果表明,SPFMVS2/A2和SPCSVS2/A2引物的特异性最强,目的片段大小为461bp,对于SPCSV病毒来说,SPCSVS2/A2引物的特异性最强,目的片段大小为304bp,最佳退火温度为56℃;在双重RT-PCR检测技术体系中,SPFMV/SPCSV的引物组合浓度比为1∶3时,目标片段扩增效果最好。对两种病毒最低检测浓度的测试结果表明,SPFMV和SPCSV两种病毒RNA的最低检测浓度相当于模板RNA浓度的10-4μL。双重RT-PCR检测技术体系的构建,为大田生产中受SPFMV和SPCSV共侵染的甘薯病毒病的预防提供技术支持。

在GenBank中搜寻虹彩病毒蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)基因序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列,设计引物和Taqman探针,建立了虹彩病毒蛙病毒属实时荧光PCR检测方法。对荧光PCR反应条件进行优化,评估该检测方法的特异性、稳定性和重复性,利用10倍系列稀释法检验其灵敏度并与常规PCR做了比较。结果显示,该方法对虹彩病毒蛙病毒属成员(新加坡石斑鱼虹彩病毒除外)的检测有高度的特异性,与淋巴囊肿病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒等其他水生动物病毒之间均无交叉反应,有良好的特异性,检测总DNA灵敏度为4.5×10-3pg/μL,比传统PCR的敏感度高出100倍,可对低病...

为了调查天津地区种植梨的已知病毒病的发病情况,以雪花梨叶片为材料,采用改良的CTAB法对梨的嫩叶进行总RNA提取,并通过RT-PCR对天津3个地区70株不同品种的梨树所带的潜隐性病毒进行鉴定,包括苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果锈果类病毒(ASSVd)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果凹果类病毒(ADFVd)。结果表明,改良方法 1-巯基乙醇法是提取梨叶片总RNA较为理想的方法,可获得的RNA杂质含量较少,总RNA得率较高,平均质量分数可达73. 880μg/g,获得的总RNA符合后续试验要求;利用RT-PCR法在70个检测样品中,上述5种病毒病的平均发生率依次为47. 1%,11. 4%,10. 0%,8. 6%,1. 4%,复合侵染率平均为28. 6%,种植年份越高的植株带毒率越高,不同品种对病毒的敏感性也不相同。研究结果表明,天津地区梨病毒病发病普遍,其中苹果褪绿叶斑病毒是主要带毒种类,而且具有一定比例的多种病毒复合侵染现象。梨树种植管理水平低,地区间梨树引种缺乏规范的检测监控均可导致梨病毒病的发生和扩散,这对于天津梨产业的健康发展十分不利。

【背景】口蹄疫（foot and mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、烈性传染病，疫苗接种是预防临床口蹄疫的有效措施。免疫抗体水平监测则是评估疫苗免疫效果、制定免疫程序的重要依据，是免疫工作和疫情防控必不可少的关键环节，因此建立高效、快速、全自动的抗体检测方法具有重要意义。【目的】基于磁微粒（micromagnetic particles,MPs）化学发光免疫分析技术（CLIA），建立一种新型、全自动、可定量的口蹄疫病毒O型抗体检测方法，为口蹄疫免疫监测和疫情防控提供技术支撑。【方法】使用纳米材料磁微粒为固相载体和分离载体包被捕获抗体，用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）标记检测抗体，经过条件优化建立了一种新型磁微粒CLIA检测方法(magnetic particle chemiluminescence immunoassay,MP-CLIA)。本方法首先加入磁微粒-兔抗偶联物(magnetic particle-polyclonal antibodies,MPs-p Abs)、待测样本、口蹄疫病毒O型抗原，37℃孵育；再加入适量酶标抗体（ALP-p Abs),37℃孵育；最后加入化学发光底物AMPPD，检测相对发光强度（relative light unit,RLU）。研究通过检测标准品拟合标准曲线，并应用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic,ROC）确定检测方法的判定标准；利用质控样本进行方法学评价，同时检测田间样本，并和液相阻断ELISA(LPB-ELISA）比对，验证临床检测效果。【结果】优化后最佳反应条件为磁微粒浓度0.25 mg·m L~(-1)、口蹄疫病毒O型抗原1﹕1 000稀释、酶标抗体1﹕2 000稀释、加样量20μL。整个检测过程均在全自动化学发光免疫分析仪中完成，反应时间20 min，在抗体含量0—1 280 U(效价0—1﹕2 048)范围内标准曲线R ~2>0.99，可进行定量检测。该方法敏感性为94.66%；特异性为97.10%，检测口蹄疫A型、Asia I型血清型特异性为97.14%，与塞内卡病毒（SVV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、牛流行热病毒（BEFV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、羊痘病毒（QRFV）、小反刍兽疫病毒（PPRV）抗体阳性血清无交叉反应；重复检测变异系数CV值<10%；田间样本检测结果与LPB-ELISA符合率为94.69%，定量结果相关系数R ~2为0.8473,P<0.0001，相关性显著。【结论】建立的MP-CLIA方法耗时短、操作简便，配套国产全自动化学发光仪，可进行全自动化检测，是一种新型、高效的口蹄疫病毒O型抗体定量检测方法，本方法对应的试剂盒已经完成中试生产和临床检测试验，在全国不同区域试用效果较好，具有较高的临床应用价值。

【目的】基于逆转录环介导等温扩增技术(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)西非株系(West African,WA)的可视化检测方法。【方法】针对SPCSV西非株系(SPCSV-WA)的CP核苷酸序列设计4条引物,以感染SPCSV-WA甘薯叶片总RNA为模板,进行一步法RT-LAMP,在65℃条件下反应1 h。扩增产物利用琼脂糖电泳分析和SYBR green I荧光染料显色判断结果,同时对扩...

【目的】测定1型鸭肝炎病毒(DHV1)毒株R全基因组,建立鸭肝炎病毒1型巢式PCR与实时荧光定量RT-PCR。【方法】设计特异性引物测定DHV1毒株R全基因组,以3D为靶基因序列的引物P1和P2,P3和P4进行巢式PCR,引物F和R进行实时荧光定量RT-PCR。【结果】序列分析发现该毒株与其它GenBank上发表的DHV1毒株基因组核苷酸序列同源性为94.2%～99.2%,编码聚合蛋白氨基酸序列同源性为98%～98.8%,表明DHV1-R株与其它DHV1毒株之间病毒基因组一级结构有较高的同源性。基因组结构5′UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3...