【目的】明确辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）在贵州烟草上的发生情况及其与我国其他省份不同ChiVMV株系之间的遗传进化关系，为制定科学合理的防控措施提供依据。【方法】从贵州省贵阳、遵义、安顺和铜仁的烟田采集表现叶片斑驳、皱缩、坏死和花叶等症状的疑似病毒侵染的烟叶样品80份。采用RT-PCR法，设计多种病毒引物对所采集的样品进行检测，对检测出的ChiVMV进一步进行PCR分段扩增以获得贵州烟草ChiVMV的全基因组序列，基于NCBI已公布的所有ChiVMV基因组序列进行序列一致性分析并构建系统发育进化树以研究贵州ChiVMV烟草分离株的遗传进化关系。【结果】RT-PCR检测结果显示，ChiVMV在贵州烟区检出率为37.50%，烟草普通花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）检出率为48.75%，马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）的检出率为35.00%，黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）检出率仅8.75%；检测出4种复合侵染类型TMV＋PVY、PVY＋ChiVMV、PVY＋CMV和ChiVMV＋PVY＋TMV，检出率分别为26.25%、6.25%、10.00%和3.75%。PCR分段扩增获得贵州省烟草分离株ChiVMV-GZ（GenBank：OP589298），其与来自四川的番茄分离株（No：KC711055）和四川烟草分离株（No：MK405594）具有较高的序列一致性（98.70%和98.50%）；构建系统发育进化树发现其与来自四川和云南的ChiVMV株系聚为一支。【结论】辣椒脉斑驳病毒在贵州烟草上的为害已日趋严重，应当引起足够重视，本研究在贵州烟草上分离获得分离株ChiVMV-GZ并扩增获得该病毒全基因组；基于遗传进化分析发现，ChiVMV-GZ与来自四川和云南的ChiVMV株系间的亲缘关系最近。

【目的】烟草花叶病毒属（Tobamovirus）是危害辣椒、烟草等茄科作物的主要病毒之一，严重影响蔬菜作物的种植和生产。本研究旨在探明侵染江苏省南京市辣椒的烟草轻绿花叶病毒（tobacco mild green mosaic virus,TMGMV）分离物（TMGMV-JS）的基因组结构特征、系统进化关系及其致病性，为TMGMV的防控提供科学依据。【方法】从江苏省南京市采集的辣椒病样，提取总RNA，利用TMGMV特异检测引物确认阳性后，设计病毒特异性全长引物扩增TMGMV-JS全基因序列，通过同源重组的方法克隆至pCB301植物表达载体上，获得TMGMV-JS分离物基因组序列和全长cDNA侵染性克隆。BLAST分析TMGMV-JS分离物与已报道分离物的同源性，利用MEGA7软件的邻接法进行系统进化分析。将侵染性克隆通过农杆菌浸润本氏烟和辣椒，经RT-PCR和Western blot检测验证侵染效果，测定TMGMV-JS分离物的致病性。【结果】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV全长序列为6 356 nt，编码4个功能蛋白，分别为126K复制相关蛋白、183K复制酶、运动蛋白MP和外壳蛋白CP。同源性分析结果显示TMGMV-JS与重庆分离物TMGMV-TN29(MF139550)同源性最高，厦门分离物（JX534224）次之，系统进化分析结果也显示TMGMV-JS与其他TMGMV聚于同一大分支，其中与重庆、厦门两个分离物在同一小分支，相对近缘。构建的pCB301-TMGMV-JS侵染性克隆载体可以系统侵染本氏烟，引起叶片黄化，植株系统性坏死；也可以系统侵染辣椒，引起叶片斑驳、卷曲和植株矮化等症状。【结论】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV-JS分离物基因组全长6 356 nt，与国内重庆、厦门TMGMV分离物具有较近的亲缘关系，同属于一个分支；构建的TMGMV-JS侵染性克隆可以系统侵染本氏烟和辣椒，在本氏烟上会导致系统性坏死。

采用鉴别寄主、血清学及ＲＴ－ＰＣＲ检测的方法对采自辽宁省葫芦岛地区的辣椒病毒进行了分离与鉴定，并将克隆得到的病毒ＣＰ基因进行测序及同源性比较。结果表明：该病毒分离物可侵染辣椒（ＣａＰｓｉＣｕｍ ｆＲｕＴｅｓＣｅｎｓ）产生局部枯斑、系统斑驳或花叶；局部侵染普通烟（ｎｉＣｏＴｉａｎａ ＴａｂａＣｕｍ）、心叶烟（ｎｉＣｏＴｉａｎａ ｇｌｕＴｉｎｏｓａ）、三生烟（ｎｉＣｏＴｉａｎａ ＴａｂａＣｕｍ．ｖａＲ．ｓａｍｓｕｎ）、矮牵牛（ＰｅＴｕｎｉａ ｈｙｂＲｉｄａ）产生坏死枯斑，在曼陀罗（ｄａＴｕＲａ ｓＴＲａｍｏｎｉｕｍ）、洋酸浆（Ｐｈｙｓａｌｉｓ ＰｕｂｅｓＣｅｎｓ）和苋色藜（ＣｈｅｎｏＰｏｄｉｕｍ ．．．

【目的】明确引起广西百色市辣椒呈现叶片上卷、皱缩等症状的病毒病原，并对各病毒分离物的遗传进化关系进行分析，旨在为辣椒病毒病的防控提供科学依据。【方法】从广西百色市采集4份疑似被菜豆金色花叶病毒属病毒感染的辣椒样品，利用PCR、分段克隆、核苷酸序列比对分析、进化树构建等方法对疑似样品进行鉴定及遗传进化分析。【结果】PCR结果显示，4个样品中均能扩增出约570bp目标PCR条带，将PCR产物直接送样测序，所得序列进行blastn分析发现，4条序列分别与已登录GenBank的TYLCV和PaLCuCNV各分离物的序列具有较高的核苷酸相似性，证实所采集的辣椒植株受到菜豆金色花叶病毒属病毒侵染。参考已登录GenBank的TYLCV（GenBank登录号:MG904859和KY783940）、PaLCuCNV（GenBank登录号:KU892661和MW779523）的序列设计2对背靠背引物，随机选择2份阳性样品进行全基因组扩增和序列测定，将所得PCR产物纯化后克隆至pMD18T载体上，挑选阳性克隆进行测序，从2份阳性样品中共获得3条病毒全长基因组序列，将所得序列在GenBank中进行Blastn分析，发现其中2条序列与已登录GenBank的部分TYLCV分离物的核苷酸相似性达到91%以上，1条序列与已登录GenBank的部分PaLCuCNV分离物核苷酸相似性在91%以上。根据双生病毒的分类标准，确定侵染广西辣椒的双生病毒为TYLCV和PaLCuCNV的不同分离物。进化树分析发现，TYLCV广西辣椒分离物BS66-1与TYLCVSG1分离物（GenBank登录号为：MT969010，寄主为番茄）具有较近的亲缘关系，而TYLCV广西辣椒分离物BS67-1则与TYLCV GX和TYLCV BS3分离物（GenBank登录号为：MW389934、MT375610，寄主均为番茄）具有较近的亲缘关系；PaLCuCNV广西辣椒分离物BS66-2则与PaLCuCNV GX01分离物（GenBank登录号：MW779523，寄主为番茄）具有较近的亲缘关系。【结论】侵染广西辣椒呈现叶片上卷、皱缩等症状的病原为TYLCV和PaLCuCNV，本研究为菜豆金色花叶病毒属病毒侵染广西辣椒的首次报道。

【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列(GenBank登录号:KX883801)设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F:CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R:TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1—3 511 nt,扩增引物序列为F:AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R:AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301—6 423 nt,扩增引物序列为F:GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGATTGCCCGTG/R:GGTGGAGATGCCATGCCGACCCTGGGCCCCTACCCGGGGAAAGG。将前后两段PCR产物通过同源重组的方法克隆到pCB301双元载体上,测序得到CGMMV-GDLZ分离物全长序列。利用CGMMV-GDLZ分离物全长序列在NCBI中进行Blast分析,然后通过MEGA7软件对CGMMV-GDLZ以及其他已经报道的CGMMV分离物进行系统进化树分析。将构建好的pCB301-CGMMV侵染性克隆注射接种本生烟验证其侵染性,然后再注射接种黄瓜、葫芦和西瓜的子叶,测定CGMMV-GDLZ分离物的致病性。【结果】RT-PCR结果证实,广东省连州市葫芦病样感染了CGMMV。CGMMV-GDLZ分离物全长序列为6 423 nt,编码4个蛋白,分别为129K复制酶(61—3 495 nt)、186K复制相关蛋白(61—5 007 nt)、运动蛋白MP(4 994—5 788 nt)和外壳蛋白CP(5 763—6 248 nt)。CGMMV-GDLZ核苷酸序列与CGMMV-eWT分离物(GenBank登录号:KY753928)同源性最高,为99.97%。系统进化树分析结果显示,CGMMV-GDLZ分离物与日本、韩国等东亚CGMMV分离物同属Group 1,在遗传距离上与山东、浙江和河南的CGMMV分离物最接近。pCB301-CGMMV侵染性克隆可以系统侵染本生烟,造成本生烟上部叶片出现皱缩、斑驳、凸起等症状,RT-PCR和Western blot进一步确认了侵染性克隆的侵染性。注射接种CGMMV-GDLZ分离物后15 dpi,葫芦和西瓜即可产生斑驳、花叶、突起、生长迟缓等症状,24 dpi时症状更明显。而15 dpi时,CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜上的症状不明显,与未接种对照植株几乎没有区别;将植株从控温接种室移入网室中,30 dpi时,黄瓜植株上部叶片开始出现斑驳和花叶,40 dpi时,症状已经非常明显。RT-PCR和Western blot检测进一步确认了上述结果。【结论】侵染广东省连州市葫芦的CGMMV-GDLZ分离物与山东、浙江和河南的CGMMV分离物很可能具有相同的传染源;CGMMV-GDLZ分离物可以侵染本生烟、黄瓜、葫芦和西瓜等作物,但对这些作物的致病性存在差异。

对侵染云南烟草的粉虱传双生病毒致病性相关分子DNAβ进行PCR扩增和克隆。对9份采自不同时间和地区的样品中的DNAβ分子的全基因组序列分析发现,9个DNAβ都具有典型双生病毒DNAβ卫星分子的基因组结构特征:在互补链上编码1个大小约为118个氨基酸的βC1蛋白,含有1个卫星分子保守区(Satellite conserved region,SCR)和1个A富含区。核苷酸同源性分析显示,9个分离物的DNAβ分子中,7个分离物的DNAβ属于TYLCCNV伴随的DNAβ分子,1个属于MYVYNV伴随的DNAβ分子,2个属于TYLCTHV伴随的DNAβ分子,1个属于TbCSV伴随的DNAβ分子。系统进化...

为探索辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMo V)的分子杂交技术检测方法,以感病辣椒叶片为试材,用改良CTAB法从辣椒叶片中提取总核酸,运用RT–PCR技术扩增出PMMo V特异片段。以带有PMMo V特异片段的质粒DNA为模板,以用PCR技术制备的地高辛标记PMMo V c DNA探针检测PMMo V。结果表明:1)干燥叶片、新鲜叶片中提取的总核酸稀释80、640倍(相当于12.5、1.60μg叶片)后仍可检测到其中的PMMo V;干燥叶片利于保存及长距离转运,利于对大批量样品进行集中检测;2)采用快速提取法提取叶片总核酸,可从稀释80倍(约12.5μg叶...

［目的］构建黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）侵染性克隆，利用RNA-Seq技术分析感染CGMMV甜瓜的转录组数据，为深入研究甜瓜对CGMMV的抗病机理奠定基础。［方法］提取感染CGMMV甜瓜叶片RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板将CGMMV全基因组分成3段分别克隆，利用同源重组法构建侵染性克隆pCB-CGMMV。再分别提取感染CGMMV甜瓜和健康甜瓜叶片总RNA送生物公司进行RNA-Seq分析，Solexa GA pipeline和SOAP软件处理数据得到Unigene。再利用GenBank和Swissprot软件对大于350 bp的Unigene进行基因功能注释，Blast2GO程序用于搜索Unigene的GO注释，WEGO软件用于GO功能分类，Inter-ProScan software程序用于COG分析，OmicShare Tools程序用于KEGG分析。［结果］pCB-CGMMV分别接种黄瓜、西瓜、甜瓜和本氏烟，植株叶片均出现明显花叶症状，RT-PCR和Western blot检测各植株系统叶，均能检测到CGMMV。进一步将感染CGMMV甜瓜和健康甜瓜叶片进行转录组分析，共筛选到1872个差异表达基因（DEGs），其中1431个DEGs上调表达，441个DEGs下调表达。GO、COG注释和KEGG通路分析表明，DEGs参与碳水化合物和脂质转运代谢、植物信号传导、MAPK级联反应以及植物-病原物互作等途径。为了验证RNA-Seq测序结果，采用qRT-PCR检测了9个基因的差异表达情况，发现与转录组数据结果基本一致。［结论］本研究成功构建了CGMMV安徽分离物侵染性克隆，分析了感染CGMMV甜瓜的转录组数据，发现感病甜瓜差异表达基因DEGs参与植物多种抗病生理代谢。

根据已报道的黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP)基因序列合成1对引物,对侵染辣椒的黄瓜花叶病毒湖北分离物的病毒外壳蛋白基因进行基因扩增和序列分析。结果表明:湖北省内不同辣椒主产区采集到的样品CP基因之间的核苷酸同源率高达98.2%~99.2%,与CMV亚组Ⅰ和亚组Ⅱ各株系之间的核苷酸同源率分别为92.1%~96.5%和72.1%~78.1%,并且和亚组Ⅰ中的IB系列株系同源率更高。由此确认这4个CMV分离物属于亚组Ⅰ中的ⅠB成员。

【目的】病毒病是广东省辣椒生产上主要病害之一,田间病株率一般为5%—30%,严重时可达100%。本研究旨在探明危害广东辣椒的病毒种类,为辣椒病毒病的防控提供理论依据。【方法】2013—2016年,从广东省广州、佛山、惠州、江门、梅州、湛江、茂名和韶关8市辣椒主要种植区采集疑似病毒病辣椒样品125份,分别提取每份辣椒病样总RNA,对从茂名、梅州、韶关3市采集的病样按地点和症状混合成7份混合病样进行小RNA深度测序分析,根据小RNA深度测序分析结果,对每种病毒分别根据小RNA深度测序拼接的基因片段序列和GenBank数据库中与该拼接序列同源性最高的病毒基因组序列保守区设计2对特异性引物,以小RNA深度测序的病样RNA为模板进行RT-PCR扩增,根据扩增效果对引物进行筛选,进一步应用筛选出的引物,对采集于广东省的125份辣椒病样分别进行RT-PCR检测,根据检测结果明确危害广东辣椒的病毒种类。【结果】从采集于广东省8市的辣椒主要种植区的125份病样中检测到14种病毒,按照检出率从高到低依次为辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)(44.0%)、甜椒内源RNA病毒(Bell pepper endornavirus,BPEV)(32.8%)、烟草轻型绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaic virus,TMGMV)(31.2%)、辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)(29.6%)、辣椒黄脉病毒1(Pepper vein yellow virus 1,PeVYV-1)(26.4%)、甜椒斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus,PVMV)(25.6%)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)(18.4%)、辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,ChiRSV)(16.8%)、辣椒黄脉病毒6(Pepper vein yellow virus 6,PeVYV-6)(16.8%)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)(15.2%)、辣椒褪绿病毒(Capsicum chlorosis virus,Ca CV)(14.4%)、蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV-2)(9.6%)、辣椒隐症病毒1(Pepper cryptic virus 1,PCV1)(8.8%)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)(4.0%)。其中,PMMoV、BPEV、TMGMV、ChiVMV、PeVYV-1和PVMV 6种病毒的检出率在25%以上,但PMMo V、Chi VMV和PVMV分布广泛,PMMo V除了茂名外,Chi VMV除了韶关外,其他7市辣椒产区均有分布;PVMV广泛分布于8市辣椒产区,根据检出率和分布范围,得出PMMo V、Chi VMV和PVMV是危害广东辣椒的优势病毒。同时发现,广东辣椒上多种病毒复合侵染现象普遍,在本研究125份病样中病毒复合侵染率达到88.0%,其中2种、3种、4种、5种、6种、7种和8种病毒复合侵染检出率分别为28.0%、25.6%、12.0%、9.6%、6.4%、1.6%和2.4%,由此可知,2种和3种病毒复合侵染是主要侵染形式。【结论】危害广东辣椒的病毒有14种,其中PMMo V、Chi VMV和PVMV为优势病毒,且复合侵染普遍,2种和3种病毒复合侵染是主要侵染形式。

根据GenBank上已登录的百合斑驳病毒(LMoV)基因组序列设计7对交叉重叠的引物,利用RT-PCR技术对铁炮百合白天堂进行检测,并经克隆测序获得百合斑驳病毒大连分离物(LMoV-DL)基因组全序列。序列分析表明:LMoV基因组由长度为9 648 bp的线状单链正义RNA组成,包括一个poly(A)尾巴,编码一个由3 096个氨基酸组成的分子量为351 kDa的多聚蛋白。同时多聚蛋白系统发育分析说明LMoV隶属于Potyvirus属一个较大的分支,在进化关系上与BYMV和ClYVV最近。

【目的】研究BaMV福州分离物BaMV-TMS1及其携带的卫星RNA(satBaMV)分离物satBaMV-TMS1的全基因组特征,明确其系统发育关系;对BaMV进行c DNA侵染性克隆构建方法的改进,为其反向遗传学体系的快速建立提供简便的方法。【方法】根据已报道的BaMV和satBaMV全长序列保守区分别设计2对和1对扩增引物,从感染BaMV的竹叶中扩增、克隆获得BaMV-TMS1和satBaMV-TMS1的全长序列,并进行序列特征分析和系统发育树构建。采用多片段无缝克隆方法将扩增得到的2个病毒DNA片

【目的】辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）是世界范围内危害辣椒的主要病毒之一。126 kDa蛋白是PMMoV编码的重要致病因子，但致病机制目前仍不清楚。本研究旨在筛选与126 kDa蛋白互作的辣椒寄主因子，为解析PMMoV的致病机制提供理论依据。【方法】首先，通过同源重组法构建诱饵载体pGBK-126 kDa；并以辣椒叶片为试验材料，利用Trizol法提取辣椒叶片总RNA，制备辣椒酵母cDNA文库；之后，使用pGBK-126 kDa对cDNA文库进行筛选，并通过NCBI和Uniprot等对筛选结果进行序列比对和生物信息学功能分析，根据比对分析结果，选取可能参与到植物抗病通路的寄主因子，克隆其全长CDS构建到pGADT7载体，酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）和荧光素酶互补（LCI）进一步验证126 kDa与寄主因子之间的互作；最后，通过瞬时过表达寄主蛋白分析其在PMMoV侵染过程中的作用。【结果】提取获得高质量辣椒RNA，无降解；获得高质量酵母c DNA文库，成功构建诱饵质粒p GBK-126 kDa，筛选得到与126 kDa蛋白互作的辣椒寄主因子18个；生物信息学分析结果显示，18个寄主因子广泛参与到植物酶系统、物质及能量代谢调节过程、DNA结合转录过程、激素合成过程以及防御响应等多个通路；选取的其中3个寄主因子（LA2、PDHE1、BXL1）在一对一酵母双杂交互作验证中均存在与126 kDa的相互作用，表明初筛的结果可靠；通过Bi FC和LCI进一步验证了126 kDa与BXL1之间体内外互作；瞬时过表达BXL1发现PMMo V的侵染受到了显著抑制。【结论】成功构建了p GBK-126 kDa诱饵质粒，基于该质粒对酵母c DNA文库进行筛选得到18个互作的寄主因子，广泛涉及植物生命活动过程中的多个通路，筛选结果验证可靠，其中，BXL1存在与126k Da的体内外相互作用，并能够抑制PMMo V的侵染。研究结果可为深入探究PMMo V的侵染机制提供良好的理论和材料基础。

烟草花叶病毒在烟草种植上为害严重。在烟草育苗前期,对育苗基质、水源、漂盘残根、育苗棚周围植物及烟草种植区病株残体、土壤用烟草花叶病毒TAS-ELISA试剂盒检测。结果表明,在水源、漂盘残根、烟草种植区病株残体、土壤中均可检测到烟草花叶病毒,在育苗棚周边8个科的14种植物中检测到烟草花叶病毒,此类毒源可能成为苗期烟草花叶病发生蔓延的初侵染源。

为了确定北京菊花产区是否发生了番茄斑萎病毒病,了解该病毒北京分离物的序列变异情况,对该地区发生的TSWV进行了分子检测,并对该病毒编码的依赖RNA的RNA聚合酶(RDRP)、多糖蛋白(Gn-Gc)、运动蛋白(NSm)、外壳蛋白(N)、非结构蛋白(NSs)等5个基因进行了序列分析。结果表明,TSWV北京地区菊花分离物(Beijing-jh)的5个编码基因与国内各分离物的进化关系较远,与来自韩国和西班牙的分离物亲缘关系较近。相似性分析表明,N基因是最为保守的基因,核酸平均相似性为97.2%,蛋白为98.6%,RDRP的变异性最大,核酸平均相似性为95.4%,蛋白为96.8%,且Beijing-jh分离物的5个基因编码的氨基酸与来自西班牙分离物的相似性最大,初步表明,该分离物可能是由于贸易活动由国外传入我国。