对侵染云南烟草的粉虱传双生病毒致病性相关分子DNAβ进行PCR扩增和克隆。对9份采自不同时间和地区的样品中的DNAβ分子的全基因组序列分析发现,9个DNAβ都具有典型双生病毒DNAβ卫星分子的基因组结构特征:在互补链上编码1个大小约为118个氨基酸的βC1蛋白,含有1个卫星分子保守区(Satellite conserved region,SCR)和1个A富含区。核苷酸同源性分析显示,9个分离物的DNAβ分子中,7个分离物的DNAβ属于TYLCCNV伴随的DNAβ分子,1个属于MYVYNV伴随的DNAβ分子,2个属于TYLCTHV伴随的DNAβ分子,1个属于TbCSV伴随的DNAβ分子。系统进化...

从云南省楚雄州和大理市采集到圆叶锦葵(Malva rotundifolia Linn.)病株,主要表现为叶片金色花叶症状,从中选取典型症状病株分离物YN2131和YN2276进行PCR扩增、克隆和测序,获得两个分离物的全基因组核苷酸序列。分析表明,2个分离物具有典型的双生病毒基因组结构,长度分别为2747 nt和2743 nt,其中YN2131与云南赛葵黄脉病毒同源性最高,YN2276与保山赛葵黄脉病毒同源性最高。YN2131和YN2276都伴随有致病相关的DNA卫星分子,YN2131β和YN2276β分别属于MYVYNV和MYVV伴随的卫星分子。这是首次在国内报道双生病毒侵染圆叶锦葵。

【目的】为深入研究植物病毒—介体昆虫—寄主植物三者互作关系及机制提供科学的理论基础。【方法】以3个不同番茄品种为供试植物,MED烟粉虱为供试昆虫及近年来发现的云南本地双生病毒的优势种PaLCuCNV和TYLCTHV为供试病毒,探究烟粉虱取食、双生病毒侵染及烟粉虱与双生病毒互作对番茄生长发育特性及SA和JA信号途径防御基因表达的影响。【结果】与对照相比,不同处理均能引起番茄植株高度、地上部鲜重和干重的降低,不同处理与不同材料之间差异较大,总体表现为烟粉虱与双生病毒互作较烟粉虱取食、双生病毒侵染对植株高度、地上部鲜重和干重的影响较大。此外,不同处理普遍引起番茄JA和SA信号途径防御基因不同程度的上调表达,只是SA信号途径基因上调幅度较JA信号途径基因的上调幅度大。【结论】植物病毒—介体昆虫—寄主植物之间的互作关系及机制复杂多样,因植物种类、昆虫种类及病毒种类的不同而不同程度地影响植物生长发育及防御基因的表达。

【目的】明确辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）在贵州烟草上的发生情况及其与我国其他省份不同ChiVMV株系之间的遗传进化关系，为制定科学合理的防控措施提供依据。【方法】从贵州省贵阳、遵义、安顺和铜仁的烟田采集表现叶片斑驳、皱缩、坏死和花叶等症状的疑似病毒侵染的烟叶样品80份。采用RT-PCR法，设计多种病毒引物对所采集的样品进行检测，对检测出的ChiVMV进一步进行PCR分段扩增以获得贵州烟草ChiVMV的全基因组序列，基于NCBI已公布的所有ChiVMV基因组序列进行序列一致性分析并构建系统发育进化树以研究贵州ChiVMV烟草分离株的遗传进化关系。【结果】RT-PCR检测结果显示，ChiVMV在贵州烟区检出率为37.50%，烟草普通花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）检出率为48.75%，马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）的检出率为35.00%，黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）检出率仅8.75%；检测出4种复合侵染类型TMV＋PVY、PVY＋ChiVMV、PVY＋CMV和ChiVMV＋PVY＋TMV，检出率分别为26.25%、6.25%、10.00%和3.75%。PCR分段扩增获得贵州省烟草分离株ChiVMV-GZ（GenBank：OP589298），其与来自四川的番茄分离株（No：KC711055）和四川烟草分离株（No：MK405594）具有较高的序列一致性（98.70%和98.50%）；构建系统发育进化树发现其与来自四川和云南的ChiVMV株系聚为一支。【结论】辣椒脉斑驳病毒在贵州烟草上的为害已日趋严重，应当引起足够重视，本研究在贵州烟草上分离获得分离株ChiVMV-GZ并扩增获得该病毒全基因组；基于遗传进化分析发现，ChiVMV-GZ与来自四川和云南的ChiVMV株系间的亲缘关系最近。

为了解粉虱传双生病毒在海南的发生情况,从海南儋州采集了3个菜豆病样,症状表现为花叶、皱缩、叶背部叶脉突起,根据粉虱传双生病毒基因组DNA基因间隔区及外壳蛋白基因保守序列设计的简并引物,对这3个样品进行了PCR检测,从其中两个样品中扩增到预期大小为522 bp的DNA片段。PCR产物经克隆后进行序列测定,BLAST分析结果表明,该序列与与印度绿豆黄花叶病毒豇豆分离物(GenBank登录号:AF481865)的同源性最高,为65.9%,说明海南菜豆中存在着粉虱传双生病毒的侵染。

在严重发生番茄曲叶病的田间,发现主要杂草鲤肠表现出叶脉褪绿黄化、叶片皱缩或卷曲等症状,田间病株率达63%;用烟粉虱传双生病毒兼并引物对随机采集的20个鲤肠病样进行PCR检测,结果发现,从这些病样中均能扩增出1条356 bp的特异片段;室内人工接种试验结果显示,鲤肠分离物可以侵染番茄而引起曲叶症状。因此,鲤肠可能是广东番茄曲叶病毒的自然中间寄主。

从云南元谋采集表现曲叶症状的番茄样品中分离粉虱传双生病毒(Whitefly-transmitted geminivirus,WTGs)分离物YN678。序列分析表明其DNA-A为单链环状,全序列长度为2739 bp,编码6个ORFs。BLAST比对发现,该分离物与双生病毒科菜豆金色黄花叶病毒属的中国番木瓜曲叶病毒HeNZM1分离物(PaLCuCNV-[HeNZM1])最为接近,相似性为98.5%,表明番茄中的分离物YN678是PaLCuCNV的1个分离物。利用WTGs卫星分子DNAβ特异引物Beta01/Beta02进行PCR扩增、克隆和测序,在YN678中扩增到DNAβ分子,全长为1357 ...

【目的】烟草花叶病毒属（Tobamovirus）是危害辣椒、烟草等茄科作物的主要病毒之一，严重影响蔬菜作物的种植和生产。本研究旨在探明侵染江苏省南京市辣椒的烟草轻绿花叶病毒（tobacco mild green mosaic virus,TMGMV）分离物（TMGMV-JS）的基因组结构特征、系统进化关系及其致病性，为TMGMV的防控提供科学依据。【方法】从江苏省南京市采集的辣椒病样，提取总RNA，利用TMGMV特异检测引物确认阳性后，设计病毒特异性全长引物扩增TMGMV-JS全基因序列，通过同源重组的方法克隆至pCB301植物表达载体上，获得TMGMV-JS分离物基因组序列和全长cDNA侵染性克隆。BLAST分析TMGMV-JS分离物与已报道分离物的同源性，利用MEGA7软件的邻接法进行系统进化分析。将侵染性克隆通过农杆菌浸润本氏烟和辣椒，经RT-PCR和Western blot检测验证侵染效果，测定TMGMV-JS分离物的致病性。【结果】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV全长序列为6 356 nt，编码4个功能蛋白，分别为126K复制相关蛋白、183K复制酶、运动蛋白MP和外壳蛋白CP。同源性分析结果显示TMGMV-JS与重庆分离物TMGMV-TN29(MF139550)同源性最高，厦门分离物（JX534224）次之，系统进化分析结果也显示TMGMV-JS与其他TMGMV聚于同一大分支，其中与重庆、厦门两个分离物在同一小分支，相对近缘。构建的pCB301-TMGMV-JS侵染性克隆载体可以系统侵染本氏烟，引起叶片黄化，植株系统性坏死；也可以系统侵染辣椒，引起叶片斑驳、卷曲和植株矮化等症状。【结论】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV-JS分离物基因组全长6 356 nt，与国内重庆、厦门TMGMV分离物具有较近的亲缘关系，同属于一个分支；构建的TMGMV-JS侵染性克隆可以系统侵染本氏烟和辣椒，在本氏烟上会导致系统性坏死。

［目的］测定水稻黑条矮缩病毒（Ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ－ｓｔＲｅａｋｅｄ ｄｗａＲｆ ｖｉＲｕｓ，Ｒｂｓｄｖ）安徽分离物全基因组序列，分析Ｒｂｓｄｖ安徽分离物与Ｒｂｓｄｖ其他分离物以及斐济病毒属（ｆｉｊｉｖｉＲｕｓ）其他成员之间的分子差异，为明确Ｒｂｓｄｖ遗传变异与进化规律提供重要信息。［方法］采用Ｒｔ－ＰｃＲ法从安徽玉米粗缩病样本中扩增Ｒｂｓｄｖ的全基因组，克隆、测序并进行序列分析。［结果］获得Ｒｂｓｄｖ安徽分离物全基因组序列。序列比对发现，Ｒｂｓｄｖ安徽分离物与其他Ｒｂｓｄｖ各个分离物ｓ１到ｓ１０的序列相似性较高，为８７．６％～９９．５％，其中与Ｒｂｓｄｖ韩国分离物（Ｒｂｓｄｖ－ｋＯＲ）序列相．．．

为分析草鱼全基因组微卫星特征并开发高多态性微卫星标记亲子鉴定平台，实验利用已发布的草鱼全基因组序列，开发高度多态、准确度高、重复单元在4～6碱基范围的微卫星标记。结果显示，在草鱼900.51 Mb基因组序列中共筛选到微卫星序列677 363个，总长度12 835 407 bp，占全基因组长度的 1.425 4%，平均跨度为1 329.43bp。其中单碱基重复序列出现最多，占比52.85%；二碱基重复序列其次，占比31.44%；再次是四碱基重复，占比8.05%，三碱基重复序列占比6.47%，五碱基重复序列占比1.12%；六碱基重复出现最少，仅占比0.07%。1～6碱基重复类型中优势重复单位分别是A/T、AC/GT、AAT/ATT、AGAT/ATCT、AATAT/ATATT、AACCCT/AGGGTT。随机挑选重复序列为4～6个碱基的110个位点设计引物，在草鱼繁殖亲本群体中扩增，筛选出15对多态性引物，经CERVUS 3.0软件分析15个位点平均期望杂合度0.802～0.959，模拟分析结果鉴定准确率为100%，置信度为95%。通过对20个家系子代192个个体进行亲本来源鉴定，所有子代均成功匹配到正确父母本，鉴定准确率达到100%。本研究分析了草鱼全基因组微卫星特征，并利用多态性微卫星位点进行草鱼亲子鉴定，为草鱼微卫星的功能和应用研究以及草鱼的育种工作奠定基础。

【目的】马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是危害烟草、马铃薯、番茄、辣椒等主要农作物的重要病毒,给农业生产带来巨大损失。论文旨在克隆Hsc70-2蛋白在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中的基因序列并分析其生物学信息,研究NbHsc70-2蛋白对PVY侵染烟草的影响,为进一步解析PVY的侵染机制提供理论依据。【方法】以本氏烟为材料,克隆NbHsc70-2蛋白的基因编码序列(coding sequence,CDS),利用MEGA 6.0进行多序列比对并构建系统进化树;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析NbHsc70-2在本氏烟各组织中的表达水平;采用在线软件BaCeILo和SignalP 4.0对NbHsc70-2进行生物信息学分析;构建NbHsc70-2-RFP融合蛋白确定该蛋白的亚细胞定位;研究PVY处理对本氏烟叶片中NbHsc70-2的影响;利用激光共聚焦观察PVY-GFP处理对NbHsc70-2-RFP定位的影响;构建NbHsc70-2 VIGS沉默体系及瞬时表达载体,采用qRT-PCR比较NbHsc70-2在沉默/过表达后对PVY表达的影响。【结果】NbHsc70-2编码649个氨基酸,系统进化树分析表明,NbHsc70-2与普通烟NaHsc70-2序列相似性最高,亲缘关系最近,属于热激蛋白家族,C端具有热激蛋白家族的高度保守基序结构;qRT-PCR分析表明,NbHsc70-2在叶中表达量最高,在根和茎中的表达量较低;BaCeILo预测及激光共聚焦显微镜观察均显示NbHsc70-2定位在细胞质中,并且PVY-GFP侵染本氏烟后NbHsc70-2-RFP部分转移至细胞核,与PVY-GFP共定位在细胞质及细胞核中;将NbHsc70-2基因沉默载体pTRV::NbHsc70-2导入本氏烟中7 d后相比于对照组,沉默组出现心叶皱缩及矮化现象;接种PVY-GFP 7 d后通过手持紫外灯观察到沉默组中无明显绿色荧光出现,而对照组中PVY-GFP系统侵染使得非接种叶片呈现荧光现象,沉默组荧光点数约为对照组28%;接种PVY后,利用qRT-PCR检测沉默NbHsc70-2后1、3、5 d的PVY CP基因积累量,结果表明沉默NbHsc70-2后PVY CP基因积累量下降,其中3 d和5 d与对照相比差异显著,基因表达水平分别为对照的14%和0.004%;将NbHsc70-2过表达载体pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2与PVY同时导入本氏烟后,结果表明相比于对照组,过表达组48 h和72 h其PVY CP基因积累量显著上升,基因表达水平分别为对照组的2.31、2.56倍。【结论】PVY侵染会引起NbHsc70-2表达量上升;NbHsc70-2是PVY侵染本氏烟重要的组成成分,沉默该基因显著抑制PVY的表达,过表达NbHsc70-2则显著提高PVY的表达,即NbHsc70-2的表达水平与PVY复制呈正相关,NbHsc70-2蛋白促进PVY对烟草的侵染。

为了分析日本囊对虾基因组中小微星序列的分布特征并开发小卫星标记,构建了日本囊对虾随机基因组文库,对其中片段长度为400-1 000bp的3 395个克隆测序,共获得总长度为1 606 711bp的DNA序列。在序列拼接后的2 815个克隆中,筛选到487个小卫星序列,其序列总长度占测序序列总长度的3.97%。小卫星序列中,以12bp重复单位的序列数量最多(8.62%),总体趋势表现为重复单位越长,相应的重复序列数目越少(R=-0.826,P<0.01)。小卫星重复单位拷贝数分布范围以8bp重复单位最广(3.1-47.6),其次是10bp(2.5-44),再次是12bp(2.2-28)。平均拷贝...

利用454高通量测序技术对枣基因组进行部分测序。经序列拼接,共获得总长约为8.4 Mb的基因组序列,从中找到15 036个微卫星重复序列。其中六碱基重复类型的重复数目最丰富,共6 033个,占重复序列总数的40.1%;其次是复合型碱基2 707个和单碱基2 575个,分别占重复序列总数的18.0%和17.1%。另外,二碱基重复1 118个,三碱基1 050个,四碱基1 218个,五碱基335个,分别占重复序列总数的7.5%,7.0%,8.1%,2.2%。通过分析发现六碱基重复类型所占比例最多,但微卫星重复单元的重复次数变化却是二碱基微卫星显著高于其他各重复类型。在单碱基重复和二碱基重复这2种类...

【目的】分离侵染贵州火龙果的蟹爪兰X病毒（Zygocactus virus X，ZyVX）和火龙果X病毒（Pitaya virus X，PiVX）基因组序列，探讨其序列差异和遗传变异。【方法】利用RT-PCR筛选含有ZyVX和PiVX的火龙果样品，然后通过RNA-seq获得ZyVX和PiVX基因组相关序列，进行序列组装、一致性比较、基因重组和系统进化分析。【结果】获得4条ZyVX贵州分离物和3条PiVX贵州分离物基因组近全长序列，长度分别为6 570～6 600 bp和6 649～6 657 bp，分别覆盖参考基因组序列的99.2%～99.6%和99.3%～99.8%。4条ZyVX贵州分离物之间的基因组序列一致性为96.7%～99.5%，与其他已报道分离物的序列一致性为91.4%～96.9%，其ORF编码的氨基酸序列一致性为93.8%～100%。3条PiVX贵州分离物之间基因组序列一致性为98.2%～98.5%，与其他已报道分离物序列一致性为98.0%～99.1%，其ORF编码的氨基酸序列一致性为97.8%～100%。ZyVX和PiVX贵州分离物基因重组分析表明未发现明显的重组事件，系统进化分析表明未发生明显的遗传分化。【结论】当前贵州ZyVX和PiVX群体的基因组序列一致性高，其变异均为单核苷酸变异，未发生基因重组和遗传分化。

采用新型的生物素-磁珠吸附微卫星富集法与传统的放射性同位素杂交法相结合的方式,研究了草鱼(Ctenopharyngodon idella)基因组中存在的微卫星资源。结果,从1 000个细菌中,挑出90个阳性克隆,把其中45个进行测序分析,在这些序列中共含有68个微卫星核心序列,有55个含有重复次数大于5次的微卫星核心序列。其中,单一型标记49个,占72%,包括CA重复单元共22个,GT重复单元共18个,其他重复单元为9个;在72%的单一型标记中,完美单一型微卫星标记为44个,占65%。另外,混合型标记共19个,13为完美混合型;在所有微卫星标记中,CA重复类型最普遍,依次为GT、GA等。在68...