为了研究鱼类低温下分子调控机制及其与活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ，ｒｏｓ）之间的关系，本实验对斑马鱼（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）胚胎成纤维ＺＦ４细胞进行不同程度的低温胁迫（１８℃和１０℃），监测其在不同低温胁迫时间下（１ Ｄ、３ Ｄ和５ Ｄ）ｒｏｓ的变化以及丝裂原活化蛋白激酶（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅＤ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ，ｍａｐｋ）通路中蛋白的表达情况。结果显示：（１）ＤｃＦＨ－Ｄａ探针法表明在低温胁迫作用下，细胞内ｒｏｓ含量增加。细胞内ｒｏｓ上升水平与外界胁迫压力成正相关。低温处理３ Ｄ后，１８℃和１０℃的细胞，其ｒｏｓ含量与对照组（２８℃）相比分．．．

为了研究双特异性磷酸酶(dual-specificity phosphatase 1,dusp1)基因与鱼类低温诱导的细胞凋亡之间的关系,本研究经Eco RI和Age1酶切构建plko.1-dusp1-sh RNA1,plko.1-dusp1-shRNA2,plko.1-negative control(nc),plko.1-EGFP的重组质粒,并分别与慢病毒包装质粒pCMV-DR8.9.1、pCMV-VSVG共同转染至293T细胞中,经293T细胞包装的病毒,感染斑马鱼(Danio rerio)胚胎成纤

低温压力会导致鱼类生理功能失调、机体损伤甚至死亡,鱼类会产生各种适应性变化来应对低温压力,其中涉及的表观遗传学机制越来越受到重视。为了探讨鱼类低温应激压力下的表观遗传学调控机制,本研究对斑马鱼(Daniorerio)胚胎成纤维细胞ZF4进行短期低温胁迫(18℃处理3d、5d和10℃处理3d、5d)和长期低温胁迫(18℃处理30 d),然后用具有不同甲基化敏感性的同裂酶HpaⅡ和MspⅠ对细胞基因组DNA进行酶切以监测细胞基因组DNA甲基化水平变化。结果显示短期低温胁迫下ZF4细胞生长受到抑制甚至死亡,而经过长期低温胁迫的ZF4细胞对低温压力产生了一定适应性。并且低温胁迫下DNA甲基化水平呈现动态变化,短期低温培养细胞的基因组DNA甲基化水平明显增高,但是长期低温培养细胞的DNA甲基化水平反而下降。此外,研究发现抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)或者共济失调–毛细血管扩张突变蛋白(ataxia telangiectasia mutated,ATM)抑制剂KU-55933可以抑制18℃5 d低温处理后的ZF4细胞DNA甲基化水平的增高,说明活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生和ATM的激活介导了DNA甲基化水平的增高。本研究结果显示,短期低温刺激下ZF4细胞ROS的产生导致DNA损伤,激活DNA损伤修复机制,进而导致基因组DNA甲基化水平上升,该研究为后期斑马鱼低温胁迫分子机制的研究奠定基础。

为探索低温压力对斑马鱼细胞组蛋白修饰的影响,建立并优化使用斑马鱼(Danio rerio)成纤维细胞ZF4进行染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)的条件。本研究分别优化了ChIP过程中裂解细胞所使用的NP-40浓度、超声破碎的时间,确定了最佳NP-40浓度为0.2%,超声时间为20 min。利用针对β-actin启动子区域的引物,通过常规PCR初步验证ChIP实验是否成功。琼脂糖凝胶电泳结果显示, IgG组常规PCR产物基本无条带,H3K27me3组条带较暗, H3K4me3和H3K27ac组有较亮条带,初步说明实验可靠。使用正常培养(28℃)与长期低温驯化(18℃, 30 d)的斑马鱼成纤维细胞ZF4作为实验材料,通过优化之后的ChIP技术进行实验。分别使用qPCR和ChIP-qPCR检测低温驯化对肿瘤坏死因子b(tumor necrosis factor b,tnfb)基因表达以及其启动子区域H3K4me3、H3K27ac、H3K27me3的影响。qPCR结果显示tnfb基因经过低温驯化后上调,而ChIP-qPCR结果显示,tnfb基因启动子区域的H3K4me3、H3K27ac富集度也出现升高, H3K27me3没有明显变化,提示低温压力可能通过影响tnfb基因启动子区域的H3K4me3、H3K27ac水平来调控tnfb基因的表达。本研究建立并优化的ChIP实验条件可以用来研究ZF4细胞组蛋白修饰变化,为下一步探索低温压力对斑马鱼细胞全基因组组蛋白修饰的影响奠定基础。

为研究冷诱导结合蛋白(CIRP)在大黄鱼低温适应过程中的作用,采用同源克隆技术获得了大黄鱼CIRP基因,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了低温胁迫下大黄鱼各组织中CIRP基因的表达变化。结果显示,大黄鱼CIRP基因cDNA序列全长1211 bp,推测编码一个由182个氨基酸组成、分子量为19 ku的蛋白。序列比对显示硬骨鱼类CIRP基因序列较为保守,特别是N端的RNA识别基序(RRM)高度保守。系统进化树分析显示大黄鱼CIRP与银鳕相似性最高(81.5%),所有硬骨鱼类聚为一个大支。慢性

越来越多的研究表明,非生物胁迫影响植物的生长发育与栽培范围。为了通过转基因方法提高栽培番茄、马铃薯对热和干旱组合胁迫的抗性,利用RT-PCR结合RACE技术,从热处理的烟草叶片中分离出了细胞质小分子热激蛋白基因。分析表明,该基因cDNA全长876 bp,包含一个480 bp的开放阅读框,编码159个氨基酸,相对分子量约为17.8 kDa,被命名为Nt-HSP17.8。Northern杂交结果显示,该基因在烟草中的表达不仅受单一胁迫如热或干旱的诱导,而且在干旱与热组合胁迫下表达量大大增加,说明该基因在耐热与干旱交叉胁迫中起重要作用。

为研究斑马鱼核糖体蛋白应对低氧胁迫的生物学功能，对低氧胁迫和常氧条件下斑马鱼（Danio rerio）鳃组织进行转录组分析，利用高通量测序检测了低氧胁迫与常氧条件下斑马鱼鳃转录组中核糖体蛋白家族基因的表达差异。结果表明：在两个不同浓度的低氧胁迫下，斑马鱼鳃组织中60个核糖体蛋白基因的表达量显著上调。其中大亚基核糖体蛋白基因35个，小亚基核糖体蛋白基因25个。在低氧胁迫下斑马鱼鳃中显著差异表达基因GO富集的前15条通路中，均包括核糖体蛋白基因，且其中的5条通路与核糖体蛋白组装合成相关。在富集到“translation”GO通路中，富集到44个核糖体蛋白基因。另外，利用前期筛选出的低氧条件下斑马鱼鳃中显著低表达的2个miRNAs，针对低氧下表达量显著上调的60个核糖体蛋白基因进行靶基因预测，结果表明：斑马鱼miR-455-3p可以同时靶向核糖体蛋白基因rpl13和rplp1来调控斑马鱼对低氧环境的适应。

【目的】硒(Se)能否通过Nod2/MAPK/mTOR途径调控金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤,有待于进一步研究。因此本研究将探究硒对金黄色葡萄球菌(S. aureus)感染的奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键蛋白表达的影响,从而为阐明硒的免疫调控机制提供理论依据。【方法】首先将bMECs以106细胞/孔接种于6孔板中,当细胞超过80%的汇合度时,用含2、4和8μmol·L~(-1)浓度硒的培养基替换原来的培养基,继续孵育12 h,然后用PBS洗涤每孔3次,将S. aureus按MOI=1:1的比例加入6孔板中,继续培养0.5 h,然后收集bMECs细胞进行相关蛋白的检测。本试验共分3大组,即对照(Con)组(bMECs)、模型(Mod)组(bMECs+S. aureus)和试验组。其中试验组又分3个亚剂量组,即Low组(bMECs+2μmol·L~(-1) Se+S. aureus)、Mid组(bMECs+4μmol·L~(-1) Se+S. aureus)和Hig组(bMECs+8μmol·L~(-1) Se+S. aureus),每组设3个重复。利用BCA蛋白测定试剂盒对收集的bMECs细胞进行总蛋白提取。应用Western blotting技术检测bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平。将蛋白样品加到10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,上样量为20μg/孔,之后将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将PVDF膜用5 mL 5%脱脂乳阻断2 h,脱脂乳脱脂后用TBST清洗后,分别用5 mL的Nod2、RIP2、JNK、AKT、mTOR和β-actin的一抗孵育过夜,回收一抗。之后在PVDF膜中分别加入5 mL上述蛋白的二抗,室温孵育2 h,回收二抗。PVDF用TBST洗涤5次,最后在暗室条件下进行化学显影。【结果】S. aureus能显著提高bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平(P<0.01)。在培养基里添加2μmol·L~(-1)的硒可极显著抑制Nod2蛋白的表达(P<0.01),在培养基里添加8μmol·L~(-1)的硒可显著抑制Nod2的表达(P<0.05),而在培养基里添加8μmol·L~(-1)硒可显著抑制RIP2蛋白的表达(P<0.01)。在培养基里添加4μmol·L~(-1)的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.05),在培养基里添加8μmol·L~(-1)的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.01)。在培养基里添加4μmol·L~(-1)硒可极显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.01),在培养基里添加8μmol·L~(-1)硒可显著抑制AKT蛋白的磷酸化水平(P<0.01)。在培养基里分别添加4μmol·L~(-1)和8μmol·L~(-1)硒均能显著抑制mTOR蛋白磷酸化水平(P

选择５种不同细菌来源的鞭毛素蛋白刺激猪外周血淋巴细胞，利用荧光定量ＰＣＲ检测相关细胞因子白介素４（ＩＬ－４）和γ－干扰素（ＩＦＮ－γ）ｍＲＮＡ的表达水平，进一步选择４个含量（０．１、１．０、５．０、１０．０μｇ·ｍ Ｌ～（－１））的创伤弧菌鞭毛素蛋白，探讨其诱导ＩＦＮ－γ的表达效果．结果表明，鞭毛素蛋白可以显著提高ＩＦＮ－γｍＲＮＡ的表达水平（Ｐ

以木薯栽培种华南8号(cv.SC8)盆栽苗为材料,研究5℃低温胁迫7 d期间叶片叶绿素含量及荧光参数、光系统Ⅱ(PSⅡ)相关蛋白表达水平的动态变化。结果表明:随着胁迫时间的延长,叶绿素a和叶绿素b含量均先下降后缓慢升高,且均在处理2 d后达到最低;低温胁迫期间,最大光合效率(Fv/Fm)、光化学量子效率(ΦPSⅡ)、光化学淬灭系数(qP)、非光化学淬灭系数(NPQ)及光合电子传递速率(ETR)均显著下降,其中Fv/Fm持续下降,ΦPSⅡ、qP和ETR在胁迫2 d后达到最低后缓慢上升,NPQ在胁迫5 d后达到最低;叶绿素含量、叶绿素荧光参数显著下降表明,胁迫后PSⅡ反应中心捕光能力、开放程度及光...

以经过连续多代抗寒选育获得的尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)耐寒品系为实验材料,克隆了尼罗罗非鱼水通道蛋白基因(AQP1)的c DNA序列,并采用实时荧光定量PCR分析方法探讨了低温胁迫对罗非鱼AQP1基因表达水平的影响。序列分析结果显示,尼罗罗非鱼AQP1 c DNA长度为1 098 bp,包含36 bp的5′端非翻译区序列、783 bp开放阅读框(ORF)和279 bp的3′非翻译区序列,编码261个氨基酸。氨基酸序列比对表明,各物种间AQP1序列的同源性较高(96%~59%)。聚类分析表明,尼罗罗非鱼首先与同属鲈形目丽鱼科的斑马拟丽鱼(Maylandia zebr...

为分析苜蓿素对脂多糖诱导下体外培养奶牛乳腺上皮细胞抗炎和乳蛋白合成相关基因表达的影响,本研究将体外培养的奶牛乳腺上皮细胞分成4组,即基础培养基(对照)和基础培养基中分别加入1μg·m L-1LPS(L)、1μg·m L-1LPS+10μg·m L-1苜蓿素(L+T)和10μg·m L-1苜蓿素(T)。结果显示,1)与对照组相比,L组奶牛乳腺上皮细胞的活性显著下降(P<0.05),而T组则显著升高(P<0.01)。2)L+T组细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于L组(P<0.01),而一氧化氮(NO)

【目的】适宜的温度是葡萄生长发育的必要条件,南方地区葡萄在成熟期常常经历连续高温环境,叶片容易失水干枯,果实会发生明显的日灼,严重地影响了其经济效益。选择不同树龄葡萄树进行高温胁迫的相关研究,以解释高温对葡萄的伤害,为生产中高温逆境的抵御措施提供理论依据。【方法】选择南方地区常见的鲜食葡萄品种‘巨峰’‘巨玫瑰’‘醉金香’‘夏黑’‘申玉’‘申丰’‘申华’和‘沪培1号’为试验材料,其中葡萄幼苗选择长势基本一致的1年生扦插苗移至人工气候培养箱,在可控条件下培养7 d后于每天10:00—16:00(模拟夏季高温发

研究了镉诱发鲫肝细胞相关的胞内游离钙离子变化,以及Ca2+-ATP酶及金属硫蛋白表达量的变化。试验分为对照组、5、10、15、20μmol/L CdCl25个组。Ca2+用Fura-2/AM方法检测,试验后24 h用荧光倒置显微镜观察细胞内游离钙离子变化;分光光度法检测Ca2+-ATP酶;石墨炉—原子分光光度法检测了细胞内镉离子浓度;免疫酶联法(ELISA)检测了金属硫蛋白(MT)含量。结果显示,镉可导致细胞存活率下降,具有一定的毒性。镉离子引起胞内Ca2+荧光强度和Ca2+-ATP酶活性增加(P<0.01)。随镉浓度升高,处理组Ca2+-ATP酶浓度活性分别是对照组的4.52、6.73、6....

为了探究鱼类体内过量游离血红蛋白对鱼体影响，本研究以草鱼为研究对象，通过体内注射血红蛋白模拟体内出血，探究血红蛋白对组织和组织中巨噬细胞的免疫调控作用。体内注射血红蛋白研究结果显示，血红蛋白的刺激导致头肾和中肾组织中明显的血红蛋白沉淀，同时提高了鱼体血清中的抗氧化相关酶活水平，促进了头肾组织中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-10的mRNA表达水平。普鲁士蓝和间接免疫荧光实验显示，头肾巨噬细胞对血红蛋白表现出了吞噬活性。荧光定量PCR检测结果显示，血红蛋白的刺激显著激活了头肾巨噬细胞中CD68、CD86、CSF和MHC-Ⅱ的mRNA表达水平。进一步的细胞因子检测结果显示，血红蛋白刺激12 h后，头肾巨噬细胞中的炎症因子（TNF-α、IL-1β和IL-4）、趋化因子（CCL20和CCL4）、IFN-α和TLR4的mRNA表达水平被显著上调表达。综上所述，本研究结果表明草鱼头肾巨噬细胞对血红蛋白具有吞噬能力，同时血红蛋白也激活了巨噬细胞中多种细胞因子的表达水平。本研究结果首次阐述了草鱼血红蛋白与巨噬细胞的相互作用关系，丰富了鱼类血液基础免疫学理论，同时也为鱼类健康养殖提供新的参考。