基于前期低温胁迫3日龄封盖子不同时间的转录组数据,对可变剪接基因(ASG)作数量、种类统计和表达谱等分析,进一步解释低温对蜜蜂化蛹影响的分子机制;同时利用rMATS软件及Omicshare在线工具对T18、T36处理组(在20℃低温下分别处理18和36 h)及CK(没有低温处理)的差异基因进行可变剪接(AS)事件分析.结果表明,在各组别(CK与T18、CK与T36、T18与T36)中鉴定出4 971个ASG,产生58 017个AS事件,以外显子跳跃、外显子选择性跳跃和可变3′端剪接3种剪接类型为主.各组别间的共有ASG为4 027个,其基因本体(GO)分类结果显示,这些ASG富集在41条GO条目上;KEGG代谢通路富集分析显示,这些ASG共富集在132条代谢通路上,极显著富集的有Wnt、Hippo、TGF-beta和胞吞作用等信号通路.上述结果表明,低温胁迫可通过ASG介导代谢、生长发育和免疫等多重功能调控蜜蜂的化蛹过程.

基于前期已获得的意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂中肠转录组数据,在全转录组水平上对意大利蜜蜂的可变剪接基因(alternatively spliced gene, ASG)进行鉴定和分析,旨在揭示ASG在宿主响应东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)胁迫中的作用.在正常意大利蜜蜂7和10日龄工蜂中肠(Am7CK、Am10CK)和东方蜜蜂微孢子虫胁迫的意大利蜜蜂7和10日龄工蜂中肠(Am7T、Am10T)样品中检测到可变剪接事件数分别为73 383、85 618、79 813和74 693次,对应的基因数分别为9 586、10 063、9 829和9 622个,平均每个ASG上发生的可变剪接事件数分别为7.66、8.50、8.12和7.76次.各样品的可变剪接事件中外显子跨越的数量最多,分别为4 411、5 247、4 993和4 629个.Venn分析结果显示,Am7CK、Am10CK、Am7T和Am10T中的共有ASG数为9 056个,特有ASG数分别为100、153、275和95个.GO分类结果显示,这些共有ASG分布在50个功能条目,特有ASG分别分布于26、30、33和24个功能条目.KEGG代谢通路富集分析结果显示,上述共有ASG富集在325个代谢通路,包括内质网蛋白加工、核糖体和RNA转运等;特有ASG分别富集在31、104、126和22个代谢通路.研究结果提供了意大利蜜蜂响应东方蜜蜂微孢子虫胁迫过程中的ASG数量和种类信息,揭示宿主ASG在胁迫响应中参与了新陈代谢和细胞免疫,为关键ASG的筛选和功能研究建立了数据基础.

蜜蜂蜂子发育具有狭温性,偏离最适温度影响蜂子正常发育.为了揭示温度胁迫对蜂子能量消耗的影响,本研究测定了29、31、35、37、38℃条件下,意大利蜜蜂工蜂封盖子不同发育阶段的能量消耗.结果表明:在29℃条件下,封盖子能量消耗受到抑制,但完成封盖期发育会增加糖、蛋白和脂肪的消耗量;31℃条件下,封盖子发育过程中的总糖和总蛋白的消耗也受到抑制,但完成封盖期发育消耗的总能量与35℃相同;37℃条件对封盖子能量消耗无影响;38℃高温胁迫抑制封盖子能量的消耗.

温度是影响蜜蜂发育的关键因子之一.为研究低温胁迫对西方蜜蜂幼虫基因表达的影响,利用高通量转录组测序技术分别对最适发育温度和低温处理的西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫的基因表达情况进行分析,获得差异表达基因(DEGs),并对DEGs进行GO功能分类和KEGG富集分析.结果显示,低温处理后共检测到98个DEGs.GO功能分类显示,DEGs富集在21条二级GO功能注释上,富集最多DEGs的GO功能注释为结合、细胞进程、代谢进程、催化活性;KEGG富集分析显示,上调和下调DEGs分别富集在25和3条通路上,主要包括甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢、核黄素代谢、昆虫激素生物合成等代谢通路,以及与信号转导相关的Hippo、Notch等信号通路.qPCR结果显示,转录组测序获得的DEGs IP3K、Ex、CYP18A1、GOD、GCDH表达差异显著.本研究结果揭示西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫主要通过提高抗氧化能力和减慢发育速度应对低温.

【目的】通过对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂中肠响应东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)胁迫的差异表达基因(differentially expressed gene,DEG)及免疫通路进行深入细致的分析,揭示宿主的细胞和体液免疫应答,为关键免疫应答基因的筛选及功能研究打下基础。【方法】基于前期获得的正常及东方蜜蜂微孢子虫胁迫的意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠(Am7CK、Am7T、Am10CK、Am10T)转录组数据,按照FDR≤1,P≤0.05和|log2 fold change|≥1的标准筛选出各组的DEG,利用相关生物信息学软件对DEG进行Pearson相关性分析、Venn分析、GO分类和KEGG代谢通路富集分析,进而对免疫通路富集基因进行统计和分析,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)验证转录组数据的可靠性。【结果】差异分析结果显示,Am7CK vs Am7T比较组包含472个上调基因和385个下调基因;Am10CK vs Am10T比较组包含611个上调基因和360个下调基因。Venn分析结果显示,两个比较组特有的DEG分别为739和853个,共有的DEG为118个。GO分类结果显示,Am7CK vs Am7T比较组中上调和下调基因分别涉及23和29个功能条目,其中富集上调基因数最多的前5位分别为结合、催化活性、代谢进程、细胞进程和单组织进程;富集下调基因数最多的前5位分别为代谢进程、单组织进程、催化活性、细胞进程和结合。Am10CK vs Am10T比较组中上调和下调基因分别涉及36和26个功能条目,其中富集上调基因数最多的前5位分别为单组织进程、结合、细胞进程、催化活性和代谢活性;富集下调基因数最多的前5位分别为结合、细胞进程、催化活性、代谢进程和单组织进程。KEGG代谢通路富集分析结果显示,Am7CK vs Am7T比较组中上调和下调基因分别富集在38和33条代谢通路,富集上调基因数最多的前5条分别为胆汁分泌、内质网蛋白加工、泛素介导的蛋白水解、PI3K-Akt信号通路和神经营养因子信号通路;富集下调基因数最多的前5条分别为胞质DNA传感通路、嘌呤代谢、嘧啶代谢、RNA聚合酶和核糖体;涉及泛素介导的蛋白水解等3条细胞免疫通路,以及PI3K-Akt信号通路等7条体液免疫通路。Am10CK vs Am10T比较组中上调和下调基因分别富集在54和43条代谢通路,富集上调基因数最多的前5条分别为Hippo信号通路、药物代谢-细胞色素P450、P450对外源物质的代谢、泛素介导的蛋白水解和鞘脂类代谢;富集下调基因数最多的前5条分别为m RNA监测、鞘脂类信号通路、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢和鞘脂类代谢;涉及泛素介导的蛋白水解等7条细胞免疫通路,以及NF-κB信号通路等2条体液免疫通路。RT-q PCR验证结果显示6个随机挑选的DEG的表达量变化趋势与测序结果一致,证实了本研究中测序数据的可靠性。进一步分析发现意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠的NF-κB信号通路均被东方蜜蜂微孢子虫激活,随即启动了3种抗菌肽apidaecin、defensin-1和hymenoptaecin的合成,体现了它们在宿主抵御东方蜜蜂微孢子虫入侵中的重要性。【结论】在转录组水平解析了意蜂工蜂中肠对东方蜜蜂微孢子虫的免疫应答,揭示宿主在胁迫前期同时作出细胞和体液免疫应答,前者可能在抵御病原入侵方面发挥主要作用;宿主的细胞免疫在胁迫后期持续增强,但体液免疫较大程度地减弱;泛素介导的蛋白水解通路及富集DEG,NF-κB信号通路及富集DEG,以及抗菌肽编码基因apidaecin、defensin-1和hymenoptaecin可能在意蜂工蜂对东方蜜蜂微孢子虫的免疫应答中起到关键作用。

【目的】为进一步鉴定金发草LEA3基因2个剪接体蛋白亲水能力和结构上的改变导致在抗逆能力方面的差异。【方法】本研究利用植物表达系统分析了2个剪接体在烟草体内的功能以及功能之间的差异。以PpLEA3基因2个剪接体(PpLEA3.a和PpLEA3.b)的重组载体pMD19-T-PpLEA3.a和pMD19-T-PpLEA3.b为模板,PCR法构建植物表达载体pBI121-PpLEA3.a和pBI121-PpLEA3.b,并分别转化烟草得到转基因烟草Nt-PpLEA3.a和Nt-PpLEA3.b。【结果】首先对转基因烟草进行分子检测,发现其基因组DNA和RT-PCR检测均表现为阳性,说明外源基因已整合到烟草基因组并可以正常转录表达。随后筛出转基因烟草并收获T2代种子后,对其进行抗旱生理特性分析,发现在遭受甘露醇150 mM的模拟干旱胁迫后,转基因植株均比野生植株生长状况好,野生植株相对矮小,叶片萎蔫,生长畸形,而转基因植株整体受损情况要好很多。同时分析了此模拟干旱条件下转基因植株与野生型植株的丙二醛含量、叶绿素含量和相对电导率的变化。【结论】转基因烟草在干旱胁迫下表现出良好的耐受性,耐受能力PpLEA3.a>PpLEA3.b。进一步说明序列上的差异对基因的抗干旱能力功能起着重要作用。

【目的】研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)和意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)体内抗寒系统的组成,为探究中蜂和意蜂耐寒性能的差异提供理论依据。【方法】试验选取室外相同环境条件越冬的中蜂和意蜂各5群,于2015年12月20日每群随机选取蜜蜂立即测定两者的过冷却点、冰点,比较其耐寒性能差异。然后分别测定蜂体游离水、结合水、脂肪、糖原和蛋白质含量以及海藻糖酶的活性。利用高效液相色谱测定血淋巴中山梨醇、海藻糖、甘露醇的含量。在海藻糖的生物合成通路中

通过探针杂交筛选斑点叉尾(Ictalurus punctatus)BAC基因组文库,利用引物步移的方法对阳性克隆BAC047 K12进行序列测定,得到2 815 bp的SCYA126基因组序列。序列分析表明,SCYA126基因由2个外显子和1个内含子组成;外显子拼接的序列与SCYA126cDNA序列完全一致,编码92个氨基酸,在N端含有2个相邻的半胱氨酸(CC)和2个不相邻的半胱氨酸,为典型的CC趋化因子亚家族成员;其上游调控序列包含TATA框启动子序列和一些与免疫相关的转录因子结合位点。另外,根据与GenBank接收号为BM029630的EST序列的比较分析,发现SCYA126基因组中的内...

CC趋化因子是一类能够促进动物体内炎症部位的各种白细胞的补充、激活和黏附的趋化性细胞因子家族,是鱼类天然免疫系统的重要组成部分。分析了从草鱼肠道cDNA文库中筛选到的CC趋化因子基因CCL24,并克隆了阅读框区域内的基因组序列。序列分析表明,CCL24基因由4个外显子和3个内含子组成;外显子拼接的序列与CCL24cDNA序列完全一致,编码95个氨基酸,有2个相邻的半胱氨酸(CC),为典型的CC趋化因子亚家族成员。此外,还发现草鱼CCL24基因存在可变剪接现象,第1内含子没有被剪切掉的非正常转录本翻译后可能产生没有CC趋化因子活性的24个氨基酸的短肽,而且这种转录本在精巢、头肾、皮肤、肝胰脏、肠...

为了克隆水稻HD2蛋白基因OsHDT703,并分析其存在的可变剪接体。利用生物信息学分析,结合RT-PCR、TA克隆和测序等方法,鉴定1个水稻中全新的HD2蛋白成员(OsHDT703)。结构域分析发现,在其N端含有HD2家族的NPL保守结构域。选取来源于7个物种的16个HD2蛋白,构建蛋白进化树,结果发现,OsHDT703蛋白与OsHDT702蛋白处于同一分支; OsHDT701则处于另一分支,说明水稻中HD2家族蛋白可能存在功能分化。根据预测的不同剪接体设计4对特异性引物,以粳稻中花11叶片和幼穗c DNA为模板,利用RT-PCR扩增,结合TA克隆,通过测序比对,成功鉴定到4种不同可变剪接体序列。由于3号(OsHDT703. 3)和4号(OsHDT703. 4)剪接体的CDS序列完全相同,所以证明OsHDT703至少存在4种不同可变剪接体。综上所述,鉴定到水稻中1个全新的HD2蛋白,命名为OsHDT703,并且鉴定出至少4种存在可变剪接体,为后续深入研究该基因生物学功能奠定基础。

为进一步探究水稻多胚候选基因OsPE的生物学功能，以粳稻品种日本晴和籼稻品种巴斯马蒂370为研究材料，选取正常生长条件下供试材料的成熟叶片，综合运用生物信息学、RT-PCR、TA克隆、半定量及qPCR等技术鉴定并分析水稻多胚候选基因OsPE的可变剪接体。结果表明，虽然生物信息学分析显示OsPE基因在粳稻中存在3种可变剪接体，在籼稻中无可变剪接体，但通过特异引物进行RT-PCR扩增，结合TA克隆及测序验证，在粳稻品种日本晴中鉴定到了OsPE基因3种可变剪接体的真实存在；在籼稻品种巴斯马蒂370中鉴定到2种新的可变剪接体。同时，半定量及qPCR结果显示：正常生长条件下，供试材料成熟叶片中OsPE基因可变剪接体存在表达差异，依次为OsPEc>OsPEa>OsPEb,且该基因在不同水稻品种中存在相同的表达趋势。最后，水稻OsPE基因编码蛋白进化分析及功能预测分析结果显示：OsPE蛋白在禾本科，尤其是稻属中高度保守(蛋白序列一致性普遍高于99%),有待于进一步研究该基因是否参与调控水稻抗逆响应、细胞分裂及细胞凋亡等生物学功能，而不是调控水稻多胚产生。综上所述，OsPE基因在禾本科，尤其是稻属中高度保守，该基因在粳稻和籼稻中可能有着相同的剪接模式，其可变剪接体在正常生长条件下存在表达差异，但表达趋势相同，OsPEc剪接体在OsPE基因功能发挥中占主导，有待于进一步研究该基因是否参与调控水稻抗逆响应、细胞分裂及细胞凋亡等生物学功能，而不是调控水稻多胚产生。

【目的】了解棉花在盐胁迫条件下相关基因的表达,并克隆与抗(耐)盐相关的重要基因。【方法】通过筛选棉花EST数据库,并对目标EST序列进行整合,对中棉所49在非盐胁迫和盐胁迫条件下进行处理并利用RT-PCR的方法克隆了质膜Na+/H+逆向转运蛋白途径中的1个蛋白磷酸化同源基因,命名为GhSOS2,并通过实时荧光定量PCR对其表达特征进行分析。【结果】序列分析表明,该基因成熟mRNA的剪接存在2种可选择性的剪接体,分别命名为GhSOS2a(GenBank登录号:GU188960)和GhSOS2b(GenBank登录号:GU188961),分别编码445和421个氨基酸残基。由于剪接方式的差异,导致...

为探明芦笋两性花、雄花发育与碳氮比及氮化合物的关系,测定了芦笋两性花与雄花性别分化的前期、中期、后期3个时期花蕾的碳、氮化合物含量,并采用RNA-seq技术分析了6个样品中相关氮化合物基因的可变剪接及表达量的差异。结果发现,在性别分化的前期、中期,两性花蕾中含碳量低于雄花蕾,但含氮量却显著高于雄花蕾;在性别分化后期,两性花蕾中含碳量与雄花蕾相当,但含氮量仍然显著高于雄花蕾。可见,较低的碳氮比有利于两性花蕾中雌蕊的发育。RNA-seq测序及GO富集分析表明,有86个氮化合物相关基因只在两性花蕾中发生可变剪接,这些基因主要编码核糖体蛋白、MADS-box转录因子和一些酶类物质等,并且在性别分化的前期、中期,分别有52,47个基因表达量高于雄花蕾。这与两性花蕾中氮化合物含量高于雄花蕾的差异一致。综上所述,氮化合物代谢相关基因的可变剪接及较高的表达量和较低的碳氮比有利于两性花雌蕊的发育。

【目的】前期已对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)7日龄工蜂中肠(Am7)、10日龄工蜂中肠(Am10)进行全转录组测序,本研究基于高质量的组学数据探究中肠发育过程中的差异基因表达谱及其调控网络,以期解析意蜂工蜂中肠发育的分子机理。【方法】根据FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)算法计算基因表达量,并以|log2 fold change|≥1且P≤0.05作为标准筛选得到差异表达基因(differentially expressed gene,DEG)。利用TargetFinder软件预测ame-miR-6001-3p的靶mRNA。利用相关生物信息学软件,对全部DEG进行GO和KEGG数据库注释。筛选出与AMPK、P13K-Akt、Wnt、cAMP、FoxO、Hippo、mTOR、Jak-STAT、Toll-like受体、TGF-beta、Notch、MAPK和NF-κB 13条信号通路存在富集关系的DEG,以及与ame-miR-6001-3p存在靶向结合关系的DEG,通过Cytoscape软件构建调控网络将其富集关系与调控关系可视化。利用茎环反转录PCR(Stem loop RT-PCR)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证ame-miR-6001-3p以及DEG在Am7和Am10中的差异表达情况。【结果】Am7 vs Am10比较组中共有1 038个DEG,包括515个上调基因和523个下调基因。这些DEG涉及细胞进程、代谢进程和催化活性等功能条目,并显著富集在氧化磷酸化、氨基糖与核苷酸糖代谢、脂肪酸代谢和嘌呤代谢等能量和物质代谢通路,表明工蜂中肠内存在旺盛细胞生命与新陈代谢活动。表达量聚类分析发现分别有20、18、15和14个DEG富集在AMPK信号通路、P13K-Akt信号通路、内吞作用和Hippo信号通路。57个DEG与P13K-Akt、Wnt、Jak-STAT等上述13条与生长发育和免疫防御相关的信号通路存在富集关系,且1个DEG可与多条信号通路存在富集关系。调控网络分析结果显示,分别有54个上调基因和44个下调基因可被ame-miR-6001-3p靶向结合;上调基因富集在磷酸肌醇代谢、胰岛素信号通路、Hippo信号通路和谷胱甘肽代谢等43条代谢通路,而下调基因富集在Hippo信号通路、新陈代谢途径、谷胱甘肽代谢和花生四烯酸代谢等20条代谢通路。RT-qPCR结果显示随机挑选的6个DEG的表达量变化趋势与测序数据一致,证实了本研究中基因差异表达真实可靠。此外ame-miR-6001-3p在Am7和Am10内均真实表达,并在Am10中的相对表达量显著较低。【结论】对意蜂工蜂中肠发育过程的DEG表达谱和DEG与ame-miR-6001-3p之间的调控关系,以及DEG的潜在作用进行深入分析和探讨,发现DEG可参与TGF-beta、Wnt、Hippo、Notch、PI3K-Akt、mTOR、AMPK和NF-κB等各类信号通路进而影响中肠的生长发育和免疫防御,DEG可通过与显著下调表达的ame-miR-6001-3p形成复杂的调控网络参与意蜂工蜂中肠发育过程中胰岛素信号通路等多条代谢途径。

【目的】对原种意大利蜜蜂(意蜂)和原种意大利蜜蜂的王浆高产品系(浆蜂)工蜂蛹期头部的蛋白质组进行比较,以探明浆蜂和意蜂3个日龄(13、15、17日龄)蛋白质表达调控方面的差异,为阐明蜜蜂发育生物学提供一定理论基础。【方法】采用双向电泳建立浆蜂和意蜂3个日龄蛹期头部蛋白质组表达谱,获得图谱中蛋白质的种类、表达量、等电点和分子量等信息,并通过质谱分析、数据库检索,鉴定部分差异蛋白。【结果】在13日龄蛹头部,浆蜂表达279个蛋白,意蜂表达268个蛋白,浆蜂和意蜂共有蛋白为212个,而浆蜂和意蜂的特异蛋白分别为67个和56个;到15日龄时,浆蜂表达296个蛋白,意蜂为277个,浆蜂和意蜂共有蛋白点为2...