【目的】探究获能和低温冷冻对猪精子细胞骨架中微管蛋白和肌动蛋白表达量的影响。【方法】利用SDS-PAGE、Western blot技术,分析获能和低温冷冻(-80和-196℃)后猪精子总蛋白质种类以及猪精子细胞骨架微管蛋白和肌动蛋白表达量的变化。【结果】低温处理后,猪精子总蛋白质的种类与新鲜精子相比发生变化,而获能处理后几乎没有差异。低温冷冻导致猪精子细胞骨架微管蛋白和肌动蛋白的表达量较新鲜精子下降,且-196℃冷冻组肌动蛋白的表达量要略高于-80℃冷冻组,但二者微管蛋白的表达量基本没有差异。获能处理后猪精子肌动蛋白表达量略有下降,而微管蛋白表达量基本没有变化。【结论】低温冷冻处理对猪精子总蛋...

【目的】探讨在气孔运动的信息传递通路中,保卫细胞微管骨架与蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸化两种因素之间是否存在相互作用,进而深入了解气孔运动机理。【方法】以拟南芥野生型及GFP-α-tubulin-6植株为材料,利用药理学试验、激光共聚焦扫描显微镜观察、免疫印迹等细胞学及生物化学方法研究丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化对保卫细胞气孔运动及微管骨架的影响。【结果】丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂星型孢菌素(staurosporine,STS)能促进光照下气孔开放,微管特异性抑制剂长春花碱(vinblastine)和微管稳定剂紫杉醇(taxol)分别减弱和增强其作用;1/2A型磷酸酶抑制剂冈田酸(okadaic ac...

为探寻肌动蛋白解聚因子（ａｃｔｉｎ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ａｄｆ）在调控肌动蛋白解聚和聚合平衡过程中发挥的作用，从橡胶树中获得了Ｈｂ ａｄｆ基因组序列，经测定，该序列长２ ２５８ ｂｐ，含有２个内含子和３个外显子，在裂殖酵母中过表达Ｈｂ ａｄｆ，获得相对分子质量约３８ ０００的融合蛋白。对裂殖酵母细胞形态进行观察，发现诱导表达Ｈｂ ａｄｆ的酵母细胞长度显著增加，双核和多核比例达６７％。实时荧光定量ｐｃｒ结果表明，Ｈｂ ａｄｆ的表达受３％Ｋｉ处理调控，在橡胶树不同死皮阶段和不同排胶时间段的表达存在变化，说明Ｈｂ ａｄｆ可能参与了橡胶树排胶和死皮的过程。

【目的】探究金雀异黄酮对冻融猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及获能相关基因的影响,为丰富猪精子冷冻保存技术的理论基础及后续开展蛋白酪氨酸激酶抑制剂对冻融猪精子获能影响研究提供参考依据。【方法】采集猪精液后,设精液冷冻对照组(CK组)、100.0μmol/L金雀异黄酮冷冻处理组(G组)和鲜精组(F组),使用Western blotting、SDS-PAGE、免疫荧光、ELISA和实时荧光定量PCR等检测各组精子的蛋白酪氨酸磷酸化水平、精子不同部位蛋白酪氨酸磷酸化位点变化情况、蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶G(PKG)活性及黏附蛋白家族基因(AQN1、AQN3、AWN、PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ)和精子运动抑制因子(SPMI)基因mRNA的表达水平,分析金雀异黄酮对冻融猪精子的保护机制。【结果】与CK组相比,G组的32和69 kD蛋白酪氨酸磷酸化水平、顶体+顶体后区磷酸化位点、PKA活性显著降低(P<0.05,下同);AWN基因相对表达量极显著升高(P

高等植物细胞内含有肌动蛋白 ,但含量较低 ,难于提取及进行进一步研究。我们用 PCR的方法扩增肌动蛋白 c DNA,并克隆到表达质粒 p Trp His,然后转化大肠杆菌 DH5α;在 IPTG诱导下 ,肌动蛋白表达在包涵体中 ,在没有 IPTG诱导时 ,肌动蛋白表达在胞液中

【目的】研究樟叶越桔肌动蛋白Actin7基因的组织表达特征。【方法】在樟叶越桔三代转录组数据库的基础上，应用PCR技术成功克隆VdActin7基因cDNA和DNA序列。进一步利用qRT-PCR技术检测并分析VdActin7基因在樟叶越桔幼嫩叶片、成熟叶片、花芽、花、绿色果实、红色果实、绿色果梗和红色果梗等组织中的表达情况。【结果】获得VdActin7基因DNA序列1657 bp, cDNA序列1387 bp。VdActin7基因含有3个内含子，分别为93 bp的intron1、89 bp的intron2和88 bp的intron3,完整开放阅读框长1134 bp,编码377个氨基酸，理论分子量为41.70 KD,等电点为5.31,无信号肽和跨膜结构，属于稳定亲水性蛋白。系统进化树分析发现，VdActin7蛋白与同为越橘属的兔眼越橘(Vaccinium ashei)Actin7亲缘关系最近。VdActin7基因密码子偏好性分析显示，总GC含量和同义密码子第三位核苷酸含量(GC3s)分别为48.2%和44.1%,有效密码子数(ENC)为49.28%,高频密码子共有31个。VdActin7与枣树(Ziziphus jujuba)ZjActin7基因相似，均对CUU偏好性最强，GUU次之，但VdActin对CUU的偏好性(3.43)明显强于ZjActin7(2.57)。qRT-PCR结果显示，VdActin7基因表达呈现明显的组织特异性，在嫩叶中高表达，在成熟叶和果梗中表达量较低，而在果实中检测不到表达量或不表达，暗示VdActin7基因可能在嫩叶的发育过程中发挥重要作用。【结论】本文首次报道了樟叶越桔Actin7基因序列及序列特征，并发现VdActin7基因具有组织表达特异性，为进一步研究VdActin7基因功能、表达调控及作用机制奠定了基础。

【目的】获得华山松大小蠹β-肌动蛋白基因序列,探讨其作为内参基因的可行性。【方法】通过比对其他昆虫β-肌动蛋白的氨基酸序列设计简并引物,用PCR的方法获得华山松大小蠹β-肌动蛋白基因片段,进一步通过RT-PCR和qRT-PCR的方法,研究β-肌动蛋白基因在华山松大小蠹不同发育阶段和成虫不同组织的表达情况。【结果】获得了1 461bp的华山松大小蠹β-肌动蛋白基因cDNA序列,与其他昆虫肌动蛋白基因核苷酸序列的相似性在86%以上,且该基因在华山松大小蠹幼虫、蛹、成虫3个发育阶段以及成虫的头、胸、腹、足、翅等组织中表达稳定,且表达量无明显差异。【结论】成功获得了华山松大小蠹β-肌动蛋白基因片段,且...

从豌豆幼苗及开花植株各器官提取总RNA，以豌豆肌动蛋白基因（PEAC1）为探针，鉴定肌动蛋白基因在不同器官的表达。Northern和Dotblot结果表明，肌动蛋白基因在豌豆中的表达具有发育阶段特异性，它倾向于在豌豆5天苗的芽和2天苗的报中特异表达。

为探讨蓖麻肌动蛋白(Actin)基因(RcActin)是否可作为蓖麻基因表达研究中的内参基因。以蓖麻生长根为试验材料,根据GenBank中公布的RcActin全长cDNA序列(登录号:XM_002522148.3)设计合成特异性引物,经PCR扩增获得RcActin的编码序列(CDS),并将其插入原核表达载体pET32a(+)中。重组表达载体pET32a(+)-RcActin转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合6个组氨酸标签的目的蛋白,表达蛋白经钴离子螯合磁珠纯化后,采用Western Blot验证,结果表明,pET32a(+)-RcActin可诱导表达分子量约为61.46 ku的融合蛋白His-RcActin。用纯化的His-RcActin免疫BALB/c小鼠,经细胞融合及筛选获得9株能分泌抗蓖麻RcActin蛋白质单克隆抗体(Monoclonal antibody, McAb)的杂交瘤细胞株。利用阳性杂交瘤细胞株刺激小鼠,取腹水,采用间接ELISA方法测定,结果表明,5株阳性单克隆细胞株腹水效价达到1∶1 000 000及以上。用蛋白A/G亲和层析法纯化His-RcActin McAb;采用间接ELISA方法对纯化McAb的特异性进行测定,3株阳性细胞株能分泌针对RcActin的特异性McAb;通过抗体亚类鉴定试剂盒鉴定纯化McAb的亚型,结果表明,3株阳性细胞株分泌的McAb亚类均为IgG1。采用间接ELISA方法对3株阳性细胞株分泌McAb的稳定性进行鉴定,获得1株在体外传19代或液氮冻存4个月后、能稳定分泌McAb的阳性细胞株。采用Western Blot和间接ELISA方法对从该细胞株中纯化的McAb的特异性、效价进行验证,结果表明,获得的McAb具有针对RcActin的特异性且效价为1∶512 000。以制备的McAb为一抗,利用Western Blot方法分析RcActin在正常水肥管理且时空一致条件下的蓖麻8个组织中的表达量,结果表明,蓖麻不同组织中RcActin的含量存在显著性差异(P<0.05)。RcActin表达研究为蓖麻功能基因表达分析中内参基因的筛选提供了一定的理论依据。

分别扩增了禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵(MBC)敏感菌株(MBCS)的β1-微管蛋白基因(β1-S)和β2-微管蛋白基因(β2-S),及多菌灵中抗菌株(MBCMR)和高抗菌株(MBCHR)的β2-微管蛋白基因(β2-MR和β2-HR),测序正确后连接到pET32a(+)原核表达载体上,转化至大肠杆菌Rosepta感受态中,经IPTG(1 mmol.L-1)诱导,得到了N末端融合6×His纯化标签的表达产物。SDS-PAGE电泳分析表明:在大肠杆菌中表达了相对分子质量约68×103的蛋白,和预测蛋白大小一致,表达的产物主要以包涵体的形式存在。表达的蛋白经HisT...

在病毒感染宿主细胞过程中,病毒利用宿主细胞骨架如微丝、微管等完成进入、运输和释放等过程。为分离鉴定石斑鱼虹彩病毒SGIV囊膜蛋白,实验应用去污剂溶解病毒囊膜,然后结合1-D-SDS-PAGE切胶分离和LC-MS/MS质谱鉴定两种方法进行检测,除了病毒编码的囊膜蛋白外,还发现7种宿主细胞来源的蛋白,包括细胞骨架微丝肌动蛋白actin等,由此推测这些宿主蛋白是与病毒纯化过程中共纯化获得。鉴于actin在病毒感染中发挥着重要的作用,进一步通过蛋白印迹、免疫电镜实验验证了actin与病毒共纯化,揭示actin是一

为了研究微管相关蛋白2(M AP 2)在促进微管形成、维持微管稳定及促进轴突和树突细胞器转运等方面的作用,试验克隆了M AP 2微管结合区基因,构建了原核表达载体pET 32a-M AP 2并对其进行诱导表达,利用亲和层析法对表达产物进行纯化,研究了表达产物与微管蛋白之间的作用。结果表明,融合表达的人M AP 2微管结合区蛋白约43 ku,可与天然的微管蛋白发生分子间的结合作用,为M AP 2生理功能的研究奠定了基础。

根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进...

植物肌动蛋白在植物顶端生长、细胞分裂分化和细胞信号转导等多种生命活动中发挥着重要作用。豌豆中存在多种肌动蛋白异型体。研究豌豆肌动蛋白异型体PEAc3与组氨酸标签(His-tag)及绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达,并分析了融合蛋白的聚合特性。采用RT-PCR的方法克隆PEAc3基因,构建原核表达载体pET30 a-His-PEAc3-GFP。用DNAman生物学软件分析表明,PEAc3融合蛋白全长675个氨基酸,分子量74.74 ku,等电点5.81。将pET30 a-His-PEAc3-GFP转入大肠杆菌BL21中,优化的诱导表达条件为:25℃,当菌液OD600达到0.8时加入IPTG(浓度...

以培养3～4 d的豌豆幼苗为试验材料,以18S rRNA基因为内参基因,豌豆幼肌动蛋白异型体PEAcII基因为检测基因,在PEG6000模拟水分亏缺条件下,采用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)体系检测肌动蛋白异型体PEAcII基因在豌豆幼苗中的表达情况。在正常供水条件下,PEAcII在处理的第8 h表达量最高,水分胁迫下,PEA-cII基因在处理的0.5 h表达量下降,在处理的1 h时表达量最高,而后下降。无论是正常供水还是水分胁迫条件下,PEAcII基因的表达都是一个动态变化的过程。试验结果表明,肌动蛋白异型体PEAcII表达量的高低可能与豌豆幼苗适应水分亏缺的生理过程有关,这对于...