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[期刊] 水产学报  [作者] 李晓晖  冯翠  王巧欣  邹桂伟  梁宏伟  
为了探究miR-17a-5p在鲢低氧胁迫下的功能,在前期鲢small RNA测序的基础上对鲢miR-17a-5p进行靶基因预测及功能富集分析,通过双荧光素酶活性验证其与HIF-1α的靶向关系,并检测低氧胁迫下miR-17a-5p和其靶基因在鲢肝脏、脑、心脏和鳃四个组织中的动态表达特征。结果显示,鲢miR-17a-5p在不同物种间高度保守,预测出381个miR-17a-5p的潜在靶基因显著富集在硫代谢、mTOR信号通路以及萜类骨架的生物合成3个KEGG信号通路上。miR-17a-5p可与HIF-1α mRNA的3′UTR结合,并降低HIF-1α mRNA水平,低氧胁迫下miR-17a-5p的表达呈下降趋势,而HIF-1α表达则呈上升趋势;3个显著富集KEGG通路中的11个miR-17a-5p潜在靶基因在低氧胁迫过程中的不同组织中的表达,尤其是肝脏中的表达,除SGK1外,均呈显著上升趋势。研究表明,低氧胁迫下鲢各组织中miR-17a-5p的表达下调减弱了其对靶基因的抑制作用,进而导致HIF-1α、ddit4和Lrp5等响应低氧胁迫的基因表达上调。本研究为低氧胁迫下鲢miRNA的表达与调控机制提供新见解,也为培育耐低氧的鲢新品系(种)提供了参考。
[期刊] 水产学报  [作者] 郑诚  薛程  赵倩倩  孙盛明  
为了研究类固醇激素合成急性调节蛋白 (StAR)在日本沼虾应答低氧胁迫过程中所发挥的作用,实验应用cDNA末端快速扩增 (RACE) PCR技术克隆了日本沼虾StAR全长cDNA序列,并利用在线软件对其序列特征进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR方法分析StAR在日本沼虾不同组织的分布情况,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)与Western blot技术对其在不同低氧胁迫阶段中的表达规律进行检测,观察低氧胁迫下精巢组织中StAR蛋白免疫组化定位。结果显示,日本沼虾StAR其cDNA全长3 361 bp (NCBI登录号:MW263908),包括5′-UTR 323 bp,3′-UTR 2 129 bp,开放阅读框909 bp,编码302个氨基酸。氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,日本沼虾StAR基因与三疣梭子蟹等甲壳动物StAR聚类一支,具有最近的亲缘关系。半定量RT-PCR检测结果显示,StAR在日本沼虾不同组织中均有表达,其表达量在肝胰腺和心脏组织中最低,在精巢组织中表达处于较高水平。使用qRT-PCR技术检测日本沼虾精巢中StAR在低氧胁迫下时空表达情况,结果表明,与对照组相比,低氧处理组精巢中StAR基因表达量在1~48 h均显著上调,而在低氧处理组96 h显著降低。此外,本实验对StAR进行了原核表达及抗血清制备,采用Western blot检测StAR蛋白表达丰度基本与基因表达模式相似,免疫组化结果显示,StAR 蛋白在精细胞与间质细胞中均有表达。综上所述,长期低氧胁迫显著降低了StAR基因的转录表达水平,并且该基因可能在类固醇合成路径及精子发生过程中均发挥重要作用。本研究结果为进一步解析日本沼虾类固醇激素合成分子机制奠定基础。
[期刊] 华北农学报  [作者] 莫远亮  邓艳  王继文  
为深入探究miR-181a-5p在鹅颗粒细胞中可能的功能及其作用机制奠定基础。以多个网络数据库资源为基础,通过生物信息学的方法预测可能的靶基因及其信号通路,然后利用q PCR检测miR-181a-5p及其靶基因在不同阶段颗粒层中的表达水平。结果显示,miR-181a-5p在脊椎动物中高度保守;靶基因的GO和KEGG分析发现,miR-181a-5p主要参与调控细胞的增殖、分化、凋亡等过程,多数靶基因主要富集到FOXO、MAPK、PI3K-Akt等信号通路;根据靶基因互作网络图,筛选出10个核心靶基因VEGFA、MAPK1、FOS、KRAS、HRAS、SIRT1、BCL2、ESR1、PTEN和CDKN1A,其中多数靶基因均与细胞增殖凋亡相关。结果表明,miR-181a-5p在2~4 mm表达量最高,但在4~6 mm急剧下降,之后在4~6 mm、8~10 mm、F5这3个阶段均呈现显著上升趋势。miR-181a-5p可能通过靶向调控SIRT1、BCL2、CDKN1B、PTEN等基因,参与FOXO、MAPK、PI3K-Akt等信号通路来调控颗粒细胞的增殖凋亡过程。
[期刊] 水产学报  [作者] 张冬梅  赵柳兰  刘巧  何阔  廖磊  罗杰  孙俊龙  杨淞  
瘦素(leptin)是一种重要的激素,参与调节动物的摄食、繁殖和能量消耗,其可以通过抑制食欲和促进能量代谢的方式维持机体能量稳态。大多数鱼类具有双重瘦素基因。在本研究中,利用PCR技术克隆了大口黑鲈leptin A基因的编码区,其开放阅读框(ORF)为486 bp,编码161个氨基酸蛋白。通过与其他物种进行同源性比对,发现鲈形目的leptin基因的保守型较高,一致性高达91.46%,在大口黑鲈leptin A中几乎不存在基因特异性突变位点,而且大口黑鲈 leptin A氨基酸序列与鳜同源性最高(92.59%),与花鲈(89.51%)、布氏鲳鲹(87.04%)、斜带石斑鱼(83.87%)的同源性次之。组织分布结果显示,leptin A基因在肝脏中的表达量最高,在心、头肾、脑、中肾、肠、脾、鳃、肌肉和性腺中的表达量均较低。此外,对大口黑鲈进行不同程度急性低氧胁迫[重度低氧(1.2±0.2)mg/L和中度低氧(3.5±0.2)mg/L],发现低氧初期时严重低氧组中度低氧组的leptin A的表达量都升高,显著高于对照组 Leptin A 的表达。这表明急性低氧能够诱导大口黑鲈leptin A在肝脏中的表达。综上所述,大口黑鲈leptin A基因与鳜leptin A基因的同源性最高,leptin A主要在大口黑鲈肝脏中显著表达,急性低氧胁迫能显著诱导leptin A的表达。
[期刊] 中国水产科学  [作者] 王春枝  李忠  梁宏伟  王丹  吴奎  邹桂伟  
为研究线粒体ATP酶F1-δ基因在鲢(Hypophthalmichthys molitrix)中的作用,采用RACE-PCR技术克隆出该基因全长,应用半定量RT-PCR法检测该基因在不同组织的表达,应用实时荧光定量PCR法检测急性低氧胁迫过程中不同溶氧浓度下该基因的组织表达变化。结果显示,鲢线粒体ATP酶F1-δ基因全长762 bp,开放阅读框480 bp,编码159个氨基酸残基,5′端非编码区114 bp,3′端非编码区168 bp。鲢与斑马鱼(Danio rerio)线粒体F1-δ编码氨基酸序列的相似性最高,达到89%;与大西洋鲑(Salmo salar)、罗非鱼(Oreochromis ...
[期刊] 上海海洋大学学报  [作者] 贾若南  林枫  许强华  
为研究斑马鱼核糖体蛋白应对低氧胁迫的生物学功能,对低氧胁迫和常氧条件下斑马鱼(Danio rerio)鳃组织进行转录组分析,利用高通量测序检测了低氧胁迫与常氧条件下斑马鱼鳃转录组中核糖体蛋白家族基因的表达差异。结果表明:在两个不同浓度的低氧胁迫下,斑马鱼鳃组织中60个核糖体蛋白基因的表达量显著上调。其中大亚基核糖体蛋白基因35个,小亚基核糖体蛋白基因25个。在低氧胁迫下斑马鱼鳃中显著差异表达基因GO富集的前15条通路中,均包括核糖体蛋白基因,且其中的5条通路与核糖体蛋白组装合成相关。在富集到“translation”GO通路中,富集到44个核糖体蛋白基因。另外,利用前期筛选出的低氧条件下斑马鱼鳃中显著低表达的2个miRNAs,针对低氧下表达量显著上调的60个核糖体蛋白基因进行靶基因预测,结果表明:斑马鱼miR-455-3p可以同时靶向核糖体蛋白基因rpl13和rplp1来调控斑马鱼对低氧环境的适应。
[期刊] 林业科学研究  [作者] 王丽丽  赵韩生  孙化雨  董丽莉  娄永峰  高志民  
MicroRNAs(miRNAs)在植物生长发育以及抗逆等过程中起着重要的调控作用。miR164作为植物特有的miRNA,其主要的靶基因是植物NAC转录因子。为揭示毛竹miR164对其靶基因的调控机制,通过茎环引物法和RT-PCR技术,从毛竹(Phyllostachys edulis)中克隆出miR164b成熟序列及其靶基因Pe NAC1。序列分析表明miR164b的靶点位于Pe NAC1编码区,RLM-5'RACE PCR产物测序结果证实切割位点位于靶点的第10-11位碱基之间。组织特异性表达分析表明,毛竹miR164b和Pe NAC1在根、茎、叶及鞘中均表达,其中miR164b在根中表达丰...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)  [作者] 赵金坤  梁宏伟  邹桂伟  王焕岭  李忠  
【目的】通过磷脂结合蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/Pi)流式细胞分析法和原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(TUneL)法检测低氧胁迫下鲢肝、脑细胞的凋亡情况。【方法】将鲢分成对照组和低氧处理组,对照组正常饲养,低氧处理组用保鲜膜将水箱上口封住进行低氧处理,分别在鲢浮头期以及死亡期取其肝、脑组织,同时取对照组鲢肝、脑组织,采用Annexin V/Pi流式细胞分析法和TUneL法检测其细胞凋亡情况。【结果】Annexin V/Pi流式细胞仪分析结果表明,在鲢肝脏中细胞凋亡率依次是对照组8.85%、低氧处理组浮头期22.06%、低氧处理组死亡期22.91%;脑中细胞凋亡率依次是对照组8.18%、...
[期刊] 中国农业大学学报  [作者] 贾富民  贾羽晴  夏晶晶  税斐  曹程程  张泰康  丁元飞  郭立平  耿照玉  金四华  
为筛选miR-133a-5p影响鸡肌肉发育的关键靶基因,本研究利用在线数据库预测miR-133a-5p靶基因,并对靶基因进行富集分析和构建蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction, PPI)网络,寻找网络图中有意义的模块。通过单因素方差分析,比较分析肌肉和其他组织中的miR-133a-5p表达量;再依据microRNA与靶基因负相关的作用机制,将miR-133a-5p靶基因与肌肉中相对下调基因取交集,筛选关键靶基因。最后,通过RNA22 v2对筛选结果进行评估。结果表明:1)共获得157个靶基因;2)GO富集分析显示,靶基因参与多个生物合成过程的调控和代谢过程;KEGG富集结果包括MAPK信号通路等多种信号通路,也包括肌动蛋白细胞骨架等与肌肉发育直接相关的通路;3)PPI网络图共筛选到4个有意义模块,涉及17个基因;4)miR-133a-5p在肌肉中表达显著上调(相对肺、肝脏和肾脏),与肌肉相对下调基因取交集后,筛选到SOX5(SRY-box 5)、PRTFDC1(Phosphoribosyl transferase domain containing 1)、THRB(Thyroid hormone receptor beta)、THBS2(Thrombospondin 2)和ARRDC3(Arrestin domain containing 3)5个基因;5)在GSE93855的表达谱中,PRTFDC1和THRB在肌肉中表达量最低,而RNA22 v2评估结果显示,仅SOX5和THRB存在P<0.05的结合位点。综上,miR-133a-5p很可能是通过SOX5、PRTFDC1、THRB、THBS2和ARRDC3影响肌肉发育,其中SOX5和THRB尤为重要。本研究为进一步研究鸡miR-133a-5p提供了理论基础和数据支撑。
[期刊] 渔业科学进展  [作者] 殷丽坤  黄凯  于凯  宿志健  郭睿婕  杨旭红  吴耀庭  
为了探究低氧胁迫下中华圆田螺(Cipangopaludina cathayensis)肝脏组织基因的差异表达,本研究通过高通量测序技术,分析中华园田螺低氧胁迫组(2.5 mg/L)和常氧组(6.9 mg/L)某些基因的差异表达,并对差异基因进行生物信息学分析,进一步采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)对关键差异表达基因进行验证。结果显示,测序共获得232 379条基因(unigene),与对照组比较,低氧胁迫组筛到176个差异基因,包含64个上调基因和112个下调基因。GO功能注释分析显示,差异基因主要富集在生物学过程中的几丁质代谢过程和含氨基葡萄糖的复合代谢过程,细胞组分中的胶原三聚体成分,分子功能中的几丁质结合功能和糖衍生物结合功能。KEGG通路富集分析显示,差异基因主要集中于环境信息处理、遗传信息处理、代谢和生物系统这4大类通路。6个关键差异基因的RT-qPCR结果显示,热休克蛋白70B2和热休克蛋白β-6基因表达量上调,几丁质酶蛋白4、α-1胶原蛋白(XIV)、α-4胶原蛋白(XIV)、5-磷酸酶蛋白基因表达量下调,证实了转录组测序结果的可靠性。本研究发现,低氧胁迫激活了中华圆田螺适应缺氧的生理活动,并获得了低氧胁迫下中华圆田螺肝脏组织中相关功能基因的表达信息,为深入研究中华圆田螺响应低氧胁迫的调控机制提供了基础数据和理论依据。
[期刊] 中国水产科学  [作者] 郭然  吴玮杰  商艳鹏  仇雪梅  丁君  李翔  田燚  
盐度是影响刺参(Apostichopus japonicas)生长发育最重要的环境因子之一,而microRNAs(miRNAs)可通过与靶基因的m RNA特异性结合,实现对其靶基因的表达调控。为探究Aja-mi R-22和Aja-mi R-27及对应的两个靶基因在刺参低盐海水胁迫下的表达情况,本实验将刺参放入盐度18低盐海水中进行胁迫,取盐度胁迫后的3 h、6 h、12h、24 h、48 h和72 h不同时间点和正常盐度海水中刺参的体腔液,提取RNA和miRNA,利用qRT-PCR技术进行表达分析。结果表明Aja-mi R-22和Aja-mi R-27这两个mi RNA在盐度胁迫后各时段均呈现出上调表达趋势,且都在胁迫后3h达到最大值,分别为对照组的36倍和16倍。Aja-mi R-22和Aja-mi R-27在胁迫后各个表达量都均高于对照组,其中Aja-miR-22在胁迫后3 h、48 h与对照组差异极显著(P
[期刊] 中国农业大学学报  [作者] 朱师良   余春林   邱莫寒   张增荣   熊霞   胡陈明   杨礼   彭涵   陈家磊   宋小燕   夏波   杨朝武  
为分析清远麻鸡不同组织中miR-142-3p的表达情况,并筛选其在脾脏中的关键靶基因,本研究利用在线数据库预测鸡miR-142-3p靶基因,并对靶基因进行GO和KEGG富集分析以及构建蛋白-蛋白互作网络。利用在线公共数据库,分析脾脏相对于其他组织的miR-142-3p表达量;再根据miRNA表达量与其靶基因表达量负相关机制,对miR-142-3p靶基因与脾脏中相对其他组织显著下调基因取交集,筛选潜在靶基因。结果表明:1)预测获得85个靶基因,GO富集分析显示,靶基因参与多种高分子化合物的合成与转运过程。2)KEGG结果显示富集到MAPK、Notch、Wnt等多条与抗肿瘤免疫相关的信号通路。3)PPI网络共筛选到4个Hub基因。4)miR-142-3p在脾脏中的表达量极显著高于肝脏、肺脏、胸肌、心脏和肾脏(P<0.01)。5)共筛选到TWF1、MYH10、NFIB、FNBP1L和FERMT2 5个靶基因。综上,鸡miR-142-3p在脾脏中很可能通过TWF1、MYH10、NFIB、FNBP1L和FERMT2发挥生物学功能。本研究为解析鸡miR-142-3p的功能及其分子机制提供了参考和依据。
[期刊] 水产学报  [作者] 李治平   姚璐   吕丽媛   董迎辉   任建峰  
HIF信号通路是动物的氧感知信号通路,对于动物在低氧环境下的代谢和能量平衡调节等发挥着重要的作用。本研究利用PCR技术克隆了缢蛏HIF信号通路中的4个关键基因HIF-1α、HIF-1β、PHD2A和PHD2B,对其编码蛋白的理化性质和结构域进行预测,并对其系统发育关系进行分析。结果显示,HIF-1包含典型的HLH、PAS、PAC、C-TAD结构域,HIF-1α特有ODDD和N-TAD结构域,ScPHD2含有zf-MYND和P4Hc结构域;不同于其他无脊椎动物,贝类包括缢蛏PHD2具有两个拷贝。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术,进一步对HIF-1和PHD2在不同发育阶段、成体不同组织和低氧(0.5 mg/L和2.0 mg/L)及干露(21 ℃干露和4 ℃干露)胁迫下的表达水平进行了分析。结果显示,缢蛏HIF-1和PHD2在卵子时期便开始表达,ScHIF-1α在检测的6个组织中的表达水平高于其他基因,且在鳃中表达最高,肝胰腺次之,ScPHD2A和ScPHD2B在6个组织的表达量均很低。低氧胁迫下,ScHIF-1α、ScPHD2表达受到显著上调,但0.5 mg/L组较2 mg/L组上调幅度更大,而ScHIF-1β表达量变化不显著。干露胁迫下,ScHIF-1β表达量变化不显著,ScHIF-1α、ScPHD2表达显著上调,且4 ℃干露组较21 ℃干露上调幅度更大。研究表明,ScHIF-1和ScPHD2分别具备典型的HIF和PHD家族特征,且在低氧下被诱导上调表达,表明其可能参与了缢蛏低氧胁迫后应答过程。研究结果为深入开展缢蛏低氧信号通路和低氧适应机制研究提供了参考价值。
[期刊] 水产学报  [作者] 赵倩倩  孙西超  郑诚  薛程  孙盛明  
为探究细胞凋亡相关基因Bax (B-cell lymphoma-2 associated X protein)在日本沼虾低氧胁迫过程中所发挥的作用,实验采用cDNA末端快速扩增(RACE) PCR技术获得日本沼虾细胞凋亡基因Bax基因cDNA全长序列,采用半定量RT-PCR与实时荧光定量PCR(qPCR)分析其在日本沼虾不同组织、不同低氧阶段的表达情况,同时采用Western blot与免疫组化分析了低氧下日本沼虾Bax蛋白的表达与定位。日本沼虾Bax基因cDNA全长2 287 bp (NCBI登录号:MZ823353),包括5 '非编码区(UTR)为42 bp,3' UTR为814 bp,开放阅读框(ORF) 1 431 bp,编码476个氨基酸。通过软件和生物信息网站对其序列进行分析,氨基酸相似度比对显示,日本沼虾细胞凋亡基因Bax富含高度保守的BH1、BH2及BH3结构域;系统进化树分析显示,日本沼虾Bax基因与斑节对虾等甲壳动物Bax聚类一支,具有最近的亲缘关系。RT-PCR结果表明,日本沼虾Bax基因在肝胰脏中表达最高,在脑中表达最低。在低氧胁迫1~96 h时,日本沼虾鳃和肝胰腺组织Bax基因表达量均显著高于对照组,这与日本沼虾Bax蛋白表达丰度基本相似。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白Bax,并将纯化重组蛋白免疫兔子获得抗血清。免疫组化结果显示,鳃和肝胰腺Bax蛋白阳性信号主要定位在鳃上皮细胞和肝细胞中。最后,采用流式细胞仪分析表明,日本沼虾血细胞凋亡率在低氧胁迫96 h时显著高于对照组,这与日本沼虾Bax基因转录水平和蛋白表达丰度相吻合。日本沼虾Bax基因在日本沼虾不同组织应答低氧胁迫分子过程中均具有促凋亡作用。为探明日本沼虾不耐低氧的分子机制提供理论参考。
[期刊] 中国水产科学  [作者] 张高伟  吴彪  刘志鸿  周丽青  孙秀俊  赵庆  杨爱国  
低氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor,HIF)是低氧信号传导途径中的关键因子,在动物低氧应答反应中发挥重要作用。为探讨魁蚶(Scapharca broughtonii) HIF-1α基因结构特征及在低氧胁迫下的应答规律,本研究以魁蚶转录组数据库中的部分序列为基础,通过cDNA末端快速扩增(rapid amplication of cDNA ends, RACE)技术克隆获得了魁蚶HIF-1α基因cDNA全长序列(命名为SbHIF-1α),并检测了其mRNA的组织分布和低氧胁迫下的表达规律。序列和结构分析显示, SbHIF-1α基因cDNA全长为2741 bp,其中包括2136 bp的ORF,编码711个氨基酸,含有HIF保守的HLH、PAS-A、PAS-B和PAC结构域,预测蛋白分子量为80.8kDa,理论等电点为5.57;SbHIF-1α与所选其他物种HIF-1α的序列相似度为56%~95%;系统进化分析显示SbHIF-1α与软体动物的遗传距离最近。qRT-PCR结果显示,在魁蚶的血淋巴、鳃、外套膜、斧足、闭壳肌和肝胰腺6个组织内均能检测到SbHIF-1α基因,在血淋巴中表达量最高,鳃次之,与其他4个组织都存在显著差异(P
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