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[期刊] 西南农业学报
[作者]
郭万柱
在国内, 四川农业大学率先系统地开展了伪狂犬病病毒(PRV) 分子生物学研究, 在构建基因文库、绘制物理图谱的基础上, 建立了放射性和非放射性分子杂交检测PRV技术; 首次构建了PRVFa株TK基因缺失株, PRVFa gI- /gp63-基因缺失株,PRV Fa gI- /gp63- /LacZ基因缺失株,测定了gp63全基因序列和gI/gp63缺失株缺失部位序列; 构建了PRV TK- 和PRVgp63- /LacZ转移载体, 为构建动物活载体疫苗创造了条件;分离、鉴定了PRV保护性糖蛋白基因gp50基因,测定了该基因序列,在世界上首次构建了伪狂犬病毒gp50基因痘苗病毒,并获得表达。
关键词：
伪狂犬病 基因缺失疫苗 进展
[期刊] 世界农业
[作者]
曾智勇 汤德元 郭万柱
疫苗免疫接种是防制和控制乃至根除伪狂犬病的根本措施,许多国家在发展和改进现有常规疫苗的同时,纷纷探索利用生物技术研制和开发安全有效的新型疫苗。为此,本文就伪狂犬病疫苗的研究做一综述,以供参考。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
颜其贵 郭万柱 余光开 王琴 娄高明
用限制性核酸内切酶NcoI消化含有伪狂犬病病毒(PRV) Fa株Bam HI-7片段的质粒PBB7,以低融点琼脂糖回收目的片段, 经连接并转化E.coliDH5a, 获得缺失了gI和部分gp63基因的重组质粒PPB7-1。将PRVFa与PPB7-1DNA共同转染PK15单层细胞,待出现50% 以上细胞病变时收获病毒, 并以蚀斑法得到纯化重组病毒株, 命名为PFDI/D63。小鼠试验证实, 缺失株对小鼠具有一定的免疫原性。
关键词：
伪狂犬病病毒 基因缺失 重组
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
方六荣 陈焕春 肖少波 王革非 马相如
对克隆有伪狂犬病病毒Ea株基因组DNASphI 15kb片段的质粒pBSA用SphI和KpnI消化 ,将含gG全基因及其上游PK基因、下游gD基因部分编码区约 2 .6kb的片段亚克隆到消除了EcoRI位点的载体pUC19中 ,获得重组质粒pUSK(E)。以pEGFP N1为模板 ,通过PCR扩增约 0 .3kb的SV40Poly(A)片段 ,并将其克隆到杆状病毒转座载体pFastBac1的NotI和PstI位点 ,利用pFastBac1的BamHI和PstI将含有 9个酶切位点以及SV40Poly(A)的片段亚克隆到pUSK(E)的相应位点 ,在插入的同时导致gG基因 5’端编码区约 40 ...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
姜焱 张常印 黄伟坚 陈溥言
在伪狂犬病病毒 (PRV)上海株gI和gE基因克隆鉴定的基础上 ,用BamHⅠ +BstpⅠ去掉gE基因的 5′端 36 3bp ,在缺失位置插入绿色荧光蛋白 (GFP)和LacZ基因 ,构建含双报告基因的PRV SH转移载体pgEI GFPZ。将pgEI GFPZ转染PRV SH的BHK 2 1细胞 ,待出现 80 %病变后收获病毒 ,并以蚀斑法得到纯化的含LacZ和GFP两种筛选标记的缺失了gE/gI的重组病毒株
[期刊] 华北农学报
[作者]
顾阳 高晓云 程琨 潘鑫龙 崔保安 陈红英
根据猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、gH基因序列,设计合成了2对特异性引物,分别建立gE和gH基因的单项PCR扩增方法。通过对PCR扩增条件的优化,建立了鉴别PRV强毒和疫苗毒的双重PCR检测方法,即利用一次PCR反应,从强毒株基因组中可同时扩增出2条大小分别为429 bp(gE基因)、355 bp(gH基因)的特异性片段,从弱毒株DNA中仅扩增出1条大小为355 bp的片段,而猪圆环病毒2型和猪细小病毒DNA扩增结果均为阴性。敏感性试验表明,所建立的双重PCR检测方法最低有效检测量为1×102TCID50/0.1 mL。该方法适合对PRV强毒和疫苗毒的快速鉴别诊断。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
曾显成 吴异健 陈家祥 姚金水 吴宝成
采集福州郊区病仔猪的鼻腔黏液、脑、脾脏、肾脏、淋巴结等组织病料,研磨上清接种到非洲绿猴肾(Vero)细胞和狗肾(MDCK)细胞进行病毒分离,通过对分离病毒株进行形态学、血清学、荧光抗体试验、动物接种试验、PCR试验等鉴定,确定所分离的病毒为猪伪狂犬病病毒(PRV),命名为PRV-FZ株.根据GenBank收录的PRV gD基因的序列设计一对引物,通过PCR方法扩增出约1579 bp的目的片段,并将其克隆到PCAGGS载体进行酶切鉴定、核苷酸序列测定和分析.结果表明,目的片段包含一个1203 bp的开放阅读框,编码400个氨基酸组成的多肽,与GenBank中有代表性的5株参考毒株相应基因序列比较...
[期刊] 华北农学报
[作者]
苗得园 杨兵 李富强 张培君 龚玉梅 李永清 付磊 高配亮
在伪狂犬病病毒种特异性单克隆抗体的基础上建立了检测该病毒抗原的单抗夹心LAB -ELISA方法。结果表明 ,该方法不与其他常见病原体产生交叉反应 ,抗原的最低检出含量为 8 9μg/mL。检测时最佳采样部位是猪脑及扁桃体。对人工感染兔、自然感染猪以及临床可疑病猪的检出率分别为 75% ,75%及 72 7% ,因此本方法是一种具有良好特异性及较好敏感性的诊断方法。
[期刊] 华北农学报
[作者]
高晓云 顾阳 潘鑫龙 郭小参 崔保安 陈红英
为了确定河南部分地区按照正常免疫程序接种猪伪狂犬病病毒(PRV)基因缺失苗的猪场是否发生了PRV野毒感染,了解新流行株的主要毒力基因g E是否发生变异,利用PCR方法,对南阳、周口、巩义、济源、漯河、原阳等地采集的疑似PRV感染的病料进行检测。对PCR检测为阳性的病料接种猪睾丸细胞,传至6代,分离出9株PRV,克隆其g E全基因并进行序列分析。结果表明,9株PRV均能扩增出1 862 bp的g E基因,且彼此之间同源性为99.9%~100%,与其他PRV毒株同源性为97.5%~99.6%。9株分离株处于一大分支上,且均含有2个氨基酸插入,在448位和510位均发生氨基酸置换。结果表明,分离株均...
关键词：
猪伪狂犬病毒 g E基因 克隆 序列分析
[期刊] 西南农业学报
[作者]
冉智光 童光志 张绍杰 王玉春 黄勇富
根据已发表的伪狂犬病毒（ＰｒＶ）的基因序列，在ＰｒＶｇＥ基因起始密码子和终止密码子的上、下游分别设计一对引物ＰＣＬ１和ＰＣＬ２，在ＰＣＬ１和ＰＣＬ２的５端分别加上ＫｐｎＩ和ＢａｍＨＩ位点，以ＰｒＶＭｉｎ－Ａ株ＤＮＡ为模板成功地扩增到约１．８ｋｂ的片段，经酶切鉴定为ＰｒＶｇＥ基因。将此ＰＣＲ产物以ＫｐｎＩ和ＢａｍＨＩ消化，回收后与经ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ酶解的ｐＵＣ１１９连接、转化，获得了明显大于载体的重组质粒，经限制性酶切和序列部分测定鉴定了阳性重组质粒ｐＲＺＥ。将ｐＲＺＥ分别经ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ酶切，回收ｇＥ基因，分别克隆到真核表达载体ｐＣＲ３－Ｕｎｉ和杆状病毒载体...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
琚春梅 陈焕春 郗鑫 刘正飞 曹胜波
目的以伪狂犬病病毒为载体,构建表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组病毒,并研究其生物学特性。方法将猪2型圆环病毒ORF2基因插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体中,构建猪2型圆环病毒-伪狂犬病病毒重组中间转移质粒,然后将该质粒与伪狂犬病病毒TK-/gG-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行重组病毒的筛选及生物学特性测定。结果利用检测PCV2ORF2基因和LacZ基因的PCR方法筛选到重组病毒TK-/gG-/ORF2+,同时用Southernblotting证实外源基因PCV2ORF2已成功插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中。间接免疫荧光试验(...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
方六荣 陈焕春 肖少波 徐引娣 何启盖
根据伪狂犬病病毒国外Ka株UL5 4基因核苷酸序列 ,设计一对包含UL5 4基因完整编码区的引物 ,以伪狂犬病病毒国内地方分离株Ea株细胞感染物为模板 ,PCR扩增出大小约 1.1kb特异性带。将纯化的扩增产物克隆到pBluescriptⅡsk +中 ,酶切分析证实后经双脱氧末端终止法进行全序列测定 ,序列分析结果表明Ea株UL5 4基因全长 10 86bp ,可编码 36 1个氨基酸。由二级结构预测数据推断C 末端具有典型的锌指结构域。运用Blast软件与Ka株UL5 4基因进行同源比较 ,发现Ea株UL5 4基因在核苷酸和氨基酸水平上均存在多处点突变 ,但无插入或缺失突变 ;将Ea株UL5...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
苏鑫铭 徐亚林 于春梅 曹瑞兵 周斌 陈溥言
根据Cre基因序列设计并合成1对引物,PCR扩增出Cre基因编码区,克隆于pIREShyg载体,得到重组质粒pIREShyg-Cre,转染HEK-293A细胞后经400μg.mL-1 Hygromycin B的筛选,将其中1个阳性克隆命名为293A-Cre。利用伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)S03109株(带有gfp报告基因表达盒及loxP位点)感染293A-Cre细胞,荧光显微镜观察、PCR及Western blot检测gfp基因的表达。结果表明,S03109感染293A-Cre二代后loxP位点间的gfp表达盒被删除,获得重组病毒S0419。将S0419感染已...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
陈前岭
用鸡胚培养法和红血球凝集(HA)试验,测定中药蛇附子注射液对伪狂犬病病毒的抑制作用。试验共分4组,第Ⅰ组接种病毒尿囊液与中药蛇附子注射液,HA滴度0。第Ⅱ组接种病毒尿囊液与磷酸奥司他韦,HA滴度0。第Ⅲ组接种病毒尿囊液与生理盐水,HA滴度7 log2。第Ⅳ组不接种病毒尿囊液,不给药,HA滴度0。结果表明,中药蛇附子注射液对鸡胚无毒性作用。中药蛇附子注射液与病毒同时接种鸡胚,能完全抑制伪狂犬病病毒在鸡胚中增殖。
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵丽 崔保安 文英会 陈红英
根据Genbank上已发表的猪伪狂犬病毒(PRV)的gH基因和猪细小病毒(PPV)的VP2基因的保守序列,设计合成了2对特异引物,分别建立了PRV和PPV的单项PCR诊断方法,通过优化PCR条件最终成功地建立了PRV和PPV的复合PCR诊断方法。敏感性检测结果表明,对PRV的检测可以达到10-10.5/100μL TCID50、对PPV的检测可以达到10-9.5/100μL TCID50。对20头份病、死猪的血清、淋巴结、肺、肝等组织进行检测,结果5头份PRV阳性,3头份PPV阳性,其中3头份PRV和PPV同时为阳性,其余猪为阴性,健康猪对照样品全部阴性。结果表明,PRV和PPV复合PCR诊断...
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