通过研究σ因子和RNase对伤寒沙门菌非编码RNA ArpH表达的影响,并结合全基因组芯片的结果,初步探讨ArpH对细菌侵袭力和胞内生存力的影响.应用qRT-PCR检测了rpoE和rpoS对ArpH转录的影响,以及RNase Ⅲ、RNase G和RNase E分别对ArpH降解的影响.另外还利用全基因组芯片技术对ArpH高表达菌株在氧应激下的基因表达谱进行分析.最后观察了ArpH对伤寒沙门菌侵袭力的影响和对胞内生存力的作用.结果显示,rpoE在酸、氧及高渗应激下、rpoS在氧应激下调节ArpH的转录.细菌中RNase Ⅲ主要参与了ArpH的降解.氧应激下高表达ArpH后,基因表达上调的有89个,基因表达下调的有24个.ArpH高表达可以减弱伤寒沙门菌对上皮细胞的侵袭力,并能增强细菌的胞内生存力.

非编码RNA在细菌的各种生命活动中都发挥着重要的功能.针对伤寒沙门菌非编码RNA AsrC,对其转录和降解特性及其所具有的功能进行初步研究.首先使用Northern blot和qRT-PCR的方法检测了σ因子rpoE和rpoS对AsrC转录的影响,分析了使用利福平抑制细菌RNA合成的情况下,RNase E和RNase III对AsrC降解的影响.其次使用AsrC缺陷株和高表达菌株分析细菌在酸、氧、高渗应激条件下的生长情况.再者通过全基因组芯片技术,研究AsrC高表达菌株基因表达的变化.进一步研究AsrC在细菌侵袭和巨噬细胞胞内生存力中的作用.结果显示,rpoE在酸应激下、rpoS在高渗应激下调节AsrC的转录.细菌中RNase E主要参与了AsrC的降解.高表达AsrC后,有40个基因表达上调,23个基因表达下调.AsrC高表达可以增强伤寒沙门菌对于上皮细胞的侵袭力,并且可以减弱细菌的胞内生存和增殖力.

为研究鼠伤寒沙门氏菌感染后不同时间鸡盲肠和脾脏组织TLR4、TLR5、TLR15和TLR21 mRNA的表达规律,选用沙门氏菌阴性济宁百日鸡36只,随机分为2组,饲喂于隔离器中,2日龄分别接种1.23×108cfu鼠伤寒沙门氏菌和PBS溶液,接种后第1、3和7天采集盲肠和脾脏组织样品,应用荧光定量PCR检测感染后各时间、各组织中TLR4、TLR5、TLR15和TLR21的表达量。结果显示,1)济宁百日鸡感染鼠伤寒沙门氏菌后盲肠中TLR4、TLR5、TLR15和TLR21表达量均发生显著变化(P<0.05);2)脾脏中TLR21和TLR4的表达量分别在接种后第1天和第3天显著上调(P<0.05)...

近年来，细菌外膜囊泡（OMVs）在抗肿瘤治疗中展现出的巨大潜力引起了广泛的关注。为探究伤寒沙门菌外膜囊泡（S. Typhi-OMVs）对人结直肠癌细胞株HT-29增殖的影响及可能的作用机制，通过超速离心法提取不同细菌的OMVs，细胞增殖实验（CCK-8）检测各细菌OMVs对细胞活力的影响；转录组测序（RNA-seq）分析处理后细胞基因表达水平的变化；试剂盒检测铁死亡相关标志物的含量变化；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹法（western blot）分别检测相关基因mRNA和蛋白质的表达变化。结果显示，在提取的6种细菌OMVs中，S. Typhi-OMVs对HT-29细胞的增殖产生了最明显的抑制作用，并且呈现出浓度和时间梯度依赖性；RNA-seq显示HT-29细胞可能发生了铁死亡；S. Typhi-OMVs作用后，细胞内发生了铁沉积，氧化产物增多，抗氧化剂减少，符合铁死亡生化特征；SAT1是S. Typhi-OMVs处理后HT-29胞内mRNA表达量变化最大的基因；p53-SAT1-ALOX15是铁死亡的信号通路之一，S. Typhi-OMVs处理后胞内p53、SAT1、ALOX15的mRNA与蛋白表达均增高。以上结果表明，S. Typhi-OMVs能够抑制结直肠癌细胞HT-29的增殖，其机制可能与通过p53-SAT1-ALOX15信号通路诱导HT-29发生铁死亡有关。

【目的】克隆鸡白痢沙门氏菌侵袭蛋白A（invA）基因并进行原核表达，分析重组蛋白invA的抗原性，为沙门氏菌快速诊断试纸条和新型表位疫苗的研发提供理论依据。【方法】以鸡白痢沙门氏菌野毒株为供试菌，克隆其invA基因，对invA基因编码的蛋白进行生物信息学分析。将invA基因克隆到pET-30a原核表达载体上，构建原核重组表达质粒pET-30a-invA，将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析，检测其目的蛋白的表达情况和免疫反应特性。

【目的】利用高密度SNP芯片完成了对北京油鸡血清免疫球蛋白Y含量等9个免疫性状的关联分析,筛选得到了与性状显著关联位点和候选基因。基于该研究结果,以集中分布在16号染色体的候选基因CD1b、BMA1(B locus M alpha chain 1)、TRIM27(tripartite motif-containing 27)和ZNF692(zinc finger protein 692)作为研究对象,以北京油鸡为实验材料,在聚肌胞(Polyinosinic acid-polycytidylic acid,Poly I:C)和细菌的处理下进一步对候选基因表达特性进行分析和鉴定。【方法】随机选取8...

[目的]通过对诱导耐药沙门菌成簇间隔的短回文重复序列(CRISPR)比对分析,以及cas(CRISPR associated)mRNA表达水平的变化,探讨CRISPR/Cas与沙门菌耐药性的关系。[方法]对鼠伤寒沙门菌ATCC13311进行耐药诱导分别获得3株体外诱导耐药(环丙沙星、庆大霉素、氨苄西林)菌和1株体内诱导耐药(环丙沙星)菌,设计引物对CRISPR,进行PCR扩增并检测,应用CRISPR Finder分析CRISPR序列,对5株沙门菌的CRISPR序列进行比对;利用RT-q PCR检测耐药前后

为开发噬菌体裂解酶作为一种新型的抗菌剂,用于沙门菌的防控,采用生物信息学及异源表达蛋白的方法,获得鼠伤寒沙门菌噬菌体T139的裂解酶,并验证裂解酶对鼠伤寒沙门菌的裂解活性。通过对鼠伤寒沙门菌噬菌体T139基因组进行分析,发现该基因组全长38 854 bp,平均GC含量为49.10%,不包含tRNA基因。进化树分析表明噬菌体T139属于T7噬菌体属,共预测出43个ORFs,有23个被赋予已知功能。多序列比对及保守结构域分析表明,orf 40基因编码的蛋白(LysT40)包含126个氨基酸残基,具有内肽酶保守结构域,为可能的噬菌体裂解酶。LysT40二级结构中存在大量的螺旋结构(70.63%),使得该蛋白能够保持结构稳定。将orf 40进行异源表达、纯化,经过SDS-PAGE和Western blot分析,在10～15 ku处获得单一目标蛋白条带,纯化的蛋白质量浓度为280μg/mL。LysT40在30 min内对氯仿或EDTA预处理的鼠伤寒沙门菌具有较好的裂解活性,吸光值OD_(600)相比于对照组分别下降0.18和0.31。

为深入了解沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶的生化特性及功能,将该酶基因克隆到表达载体中,转入大肠杆菌中诱导表达,表达产物经monomeric avidin-Sepharose亲和层析分离纯化,获得了纯的沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶。结果表明:纯化后的草酰乙酸脱羧酶经SDS-PAGE检测,呈现3条蛋白谱带,相对分子质量分别为65×103、46×103、8.8×103左右;该酶不耐高温,50℃温浴1h后活力几乎完全丧失;其最适pH为6.0左右;1mmol·L-1Zn2+、0.5mmol·L-1草酸和20mmol·L-1丙酮酸几乎完全抑制该酶的活力,10～20mmol·L-1NaCl对该酶有明显激活作用,但200～...

为分析当前西藏地区牦牛源沙门菌耐药性与分子特征，本研究对源自西藏地区内的30株沙门菌牦牛粪便分离株，采用药敏纸片法测定相关菌株对β-内酰胺类，喹诺酮类和氨基糖苷类三大类共22种抗生素的耐药情况；采用PCR扩增的方式检测bla_(TEM)、bla_(CTX)和bla_(CMY)等18种耐药基因，并采用卡方检验（Chi-square test）和费希尔精确检验（Fisher）分析耐药表型和耐药基因携带情况的相关性，将相关耐药基因进行扩增测序，并应用序列综合分析软件（CLC Sequence Viewer 7.5和MAGA7.0）分析β-内酰胺类耐药基因（bla_(TEM)）和氨基糖苷类耐药基因（armA）编码翻译相关的氨基酸关键位置点位差异与耐药性的关系。结果表明：1）分离的30株沙门菌对于β-内酰胺类存在比较严重耐药现象，30株沙门菌对苯唑西林（OX）耐药占比最多，为60%，对青霉素（PG）、哌拉西林（PRL）、阿莫西林（AMX）、氨苄西林（AM）、羧苄西林（CB）、头孢氨苄（CN）、头孢呋辛（CXM）、头孢曲松（CRO）、头孢拉定（RAD）、头孢他啶（CAZ）、头孢哌酮（CFP）和头孢唑林（CZO）耐药率分别为56.67%、43.33%、40.00%、53.33%、53.33%、46.67%、56.67%、53.33%、50.00%、46.67%、56.67%和30.00%；对喹诺酮药物均为敏感；对氨基糖苷类药物中的链霉素（SM），耐药率为60.00%，卡那霉素（KAN）、妥布霉素（CAS）、阿米卡星（AKM）耐药率分别为13.33%、33.33%和30.00%。2)30株沙门菌的优势耐药谱型为PG/OX/PRL/AMX/AM/CB/SM。3)β-内酰胺类相关的耐药基因bla_(TEM)携带率较高（53.30%,16/30），且bla_(TEM)与β-内酰胺类药物对青霉素（PG）、苯唑西林（OX）、哌拉西林（PRL）、阿莫西林（AMX）、氨苄西林（AM）、羧苄西林（CB）、头孢氨苄（CN）、头孢呋辛（CXM）、头孢拉定（RAD）、头孢他啶（CAZ）和头孢哌酮（CFP）的耐药性相关性，呈现出显著相关（P<0.05），氨基糖苷类相关耐药基因armA携带率为60%(18/30），且与妥布霉素（CAS）、链霉素（SM）、阿米卡星（AKM）的耐药性相关性，呈现出显著相关（P<0.05）。4）部分bla_(TEM)和armA编码翻译的氨基酸存在可能与沙门菌耐药能力有关的差异位点。综上，西藏地区沙门菌对β-内酰胺类药物和氨基糖苷类耐药情况形势十分严峻，西藏地区沙门菌对β-内酰胺类药物和氨基糖苷类药物耐药率高的原因是因为其携带耐药基因bla_(TEM)和armA，且与氨基酸位点突变有关。本研究为加强对西藏地区牦牛源沙门菌耐药性监测提供理论依据。

克隆滩羊脂肪肥胖相关基因(FTO)的编码区序列(CDS),采用生物学软件和在线预测工具对FTO基因进行分子特征分析，通过实时荧光定量PCR检测FTO基因mRNA在滩羊各组织以及不同绵羊群体背最长肌中的表达水平，为研究FTO基因在滩羊及其杂交后代的生产性能以及新品种选育提供参考数据。结果表明：滩羊FTO基因CDS全长1 560 bp,编码519个氨基酸，存在1个错义突变，导致缬氨酸突变为蛋氨酸；滩羊FTO蛋白为亲水性蛋白，不存在跨膜结构，在第33～34氨基酸残基处具有信号肽；构建的系统发育进化树显示，滩羊与山羊的亲缘关系最为接近。FTO基因mRNA在滩羊背最长肌中的表达水平最低，在不同绵羊群体背最长肌中的表达水平存在显著差异，表达水平表现为：杜泊羊>杜滩寒杂交一代>滩羊>小尾寒羊；肉用绵羊(杜泊羊)FTO基因mRNA的表达水平相对高于其他非肉用品种。

【目的】长链非编码RNA(lncRNA)在真核生物的基因表达、表观遗传和细胞周期调控等方面发挥重要功能。本研究旨在探究意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂中肠发育过程中lncRNA的表达谱及其作用。【方法】利用RNA-seq技术和链特异性建库方法对意蜂7和10日龄工蜂中肠(Am7、Am10)进行深度测序,下机的原始数据经过Perl脚本过滤得到高质量有效读段。利用bowtie工具将有效读段比对核糖体数据库,进一步利用Top Hat2软件将未比对到核糖体数据库上的数据比对到参考基因组。利用CPC和CNCI软件对转录本的编码能力进行预测。通过RT-PCR对部分lncRNA进行鉴定。利用edgeR软件进行差异表达lncRNA(DElncRNA)分析,进而预测lncRNA的上下游基因,并对上下游基因进行GO及KEGG代谢通路富集分析。联用RNAhybrid、Miranda和Target Scan软件预测DElncRNA靶向结合的mi RNA及mi RNA靶向结合的靶基因,并通过Cytoscape软件构建DElncRNAs-mi RNAs-m RNAs的调控网络。最后,通过RT-qPCR验证测序数据的可靠性。【结果】Am7和Am10的深度测序分别获得134 802 058和147 051 470条原始读段,经严格过滤分别得到134 166 157和146 293 288条有效读段;共得到3 890个DElncRNA,包括2 005个上调lncRNA与1 885个下调lncRNA。RT-PCR验证结果显示共有8个lncRNA能扩增出符合预期的目的片段,表明预测出的lncRNA真实存在。DElncRNA的上下游基因数为1 793个,它们涉及42个GO条目,包括代谢进程、发育进程、细胞进程、应激反应和免疫系统进程等;这些上下游基因还涉及251条代谢通路,包括碳代谢、嘌呤代谢和脂肪酸的生物合成等物质代谢通路,硫代谢、甲烷代谢和氧化磷酸化等能量代谢通路,Hippo信号通路、Wnt信号通路和Notch信号通路等信号通路,溶酶体、内吞作用和泛素介导的蛋白水解等细胞免疫通路,以及MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路和NF-kappa B信号通路等体液免疫通路,上述结果表明DElncRNA在意蜂中肠发育过程中参与物质和能量代谢、细胞生命活动和免疫调控。进一步分析发现TCONS_00020918可通过调控西方蜜蜂王浆主蛋白1编码基因在意蜂工蜂中肠的营养吸收、级型分化中发挥功能。DElncRNA的调控网络分析结果显示DElncRNA与mi RNA、m RNA间存在复杂的调控关系,部分DElncRNA处于调控网络的中心位置且能靶向结合较多的mi RNA,也有部分mi RNA可被多个DElncRNA共同靶向,表明这些DElncRNA可能在中肠发育中发挥重要作用。随机挑取5个DElncRNA进行RT-qPCR验证,结果显示它们的表达量变化趋势与测序结果一致,证实了本研究测序数据的可靠性。【结论】差异表达长链非编码RNA(DElncRNA)广泛参与意蜂工蜂中肠的新陈代谢、细胞活动和免疫调控并作为竞争性内源RNA(ce RNA)发挥作用,研究结果为关键lncRNA的筛选和功能研究提供了必要的数据支持。

【目的】探究枣类钙调蛋白（ZjCML）在抗寒性中的重要作用，旨在挖掘关键抗寒ZjCML基因，为进一步利用其进行枣抗寒育种提供理论参考。【方法】本研究利用生物信息学技术，全面分析了枣CML基因家族成员的数目及相关结构特征，并利用RNA-seq和实时荧光定量PCR技术分析其响应低温胁迫时的表达模式，为筛选关键抗寒基因奠定基础。【结果】在枣基因组数据中共鉴定到23个ZjCML基因，不均匀地分布在12条染色体上。与拟南芥CMLs蛋白构建进化树分析发现ZjCMLs可被分为12个类群。蛋白网络互作预测发现16个ZjCMLs存在于该网络中，且具有一定的互作关系。RNA-seq结果表明ZjCML13和ZjCML6基因表达模式在‘冬枣’及其同源四倍体响应低温胁迫中具有显著差异，其中ZjCML13在‘冬枣’响应低温胁迫6和24 h时极显著上调表达，而在‘冬枣’同源四倍体中表达差异不显著。外源Ca Cl2和褪黑素处理后，ZjCML13在‘冬枣’同源四倍体响应低温胁迫6和24 h时极显著上调表达，说明其可能通过诱导ZjCML13表达调控‘冬枣’同源四倍体抗寒性。【结论】枣CML基因家族具有特定的结构特征及响应低温胁迫，ZjCML13可能在调控‘冬枣’及其同源四倍体抗寒性差异中发挥重要作用。

【目的】克隆西农萨能奶山羊胰岛素诱导基因1(INSIG-1)编码区,并对其进行序列特征分析和组织表达规律研究。【方法】提取西农萨能奶山羊总RNA,反转录cDNA后进行PCR反应,对克隆得到的INSIG-1序列进行生物信息学分析。用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测INSIG-1在皮下脂肪、胸部肌肉、乳腺、肝脏、肾脏、心脏、肺、脾脏、瘤胃、小肠10个组织中的表达情况。【结果】获得西农萨能奶山羊INSIG-1基因1 014bp序列(Gen-Bank登录号JQ665439),其中编码区序列长度为831bp,编码276个氨基酸。西农萨能奶山羊INSIG-1编码区与牛(GenBank登录号NM_0...

肝脏表达抗菌肽2 (liver-expressed antimicrobial peptide 2， LEAP-2)在鱼类先天免疫系统中发挥重要作用。本研究通过RACE技术获得了俄罗斯鲟LEAP-2 (Acipenser gueldenstaedti LEAP-2， AgLEAP-2)的全长cDNA序列，对其序列特征和表达水平进行了分析；构建AgLEAP-2原核表达载体并对重组蛋白进行纯化；进一步采用琼脂稀释法初步检测AgLEAP-2蛋白的抑菌活性。结果显示，AgLEAP-2基因cDNA全长为622 bp，开放阅读框(open reading frame， ORF)为246 bp，预测编码81个氨基酸，分子量约为11.2 kDa，5′端非编码区为184 bp，3′端非编码区为192 bp。AgLEAP-2包含一个信号肽(1～25 aa)和一个成熟肽(26～81 aa)，成熟肽含有4个保守的半胱氨酸残基，在Cys58-Cys69和Cys64-Cys74的相对位置之间各形成一个二硫键的核心结构。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)结果显示，AgLEAP-2在所有健康组织中广泛表达，在肝脏中表达水平最高，在肠道和肌肉中表达水平次之，在鳃中表达量最低。与0 h相比，AgLEAP-2在感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后的不同时间点的肝脏、脾脏、肠道、头肾、鳃和血液组织中均显著上调。此外，重组AgLEAP-2 (rAgLEAP-2)蛋白在体外对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有抗菌活性并存在剂量效应。本研究表明，AgLEAP-2可能在俄罗斯鲟的先天免疫系统中发挥重要作用且对多种病原菌有一定的抗菌效果，本研究为开发新的抗菌制剂提供了依据。