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[期刊] 渔业科学进展
[作者]
朱旭 兰文升 刘荭 高隆英 杜鹃 陈孝煊
应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从传染性造血器官坏死病毒(Infectious hemato-poietic necrosis virus,IHNV)感染的细胞悬液克隆病毒的糖蛋白基因,将其亚克隆至原核表达载体pCWori,转化到大肠杆菌DH5α,通过发酵大肠杆菌制备病毒糖蛋白。经SDS-PAGE分析,诱导表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,使用Ni-NTA亲和层析柱在变性条件下进行纯化并透析复性,最终得到了较高纯度的可溶性糖蛋白,分子量约为57kDa。Western-blot分析结果显示,所表达的蛋白能够被IHNV病毒制备的兔抗IHNV血清识别。用复性后的蛋白免疫小鼠制备抗血清,E...
[期刊] 水产学报
[作者]
赵景壮 徐黎明 刘淼 曹永生 尹家胜 刘红柏 卢彤岩
糖蛋白（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｇ）是鱼类传染性造血器官坏死病毒的主要表面抗原，是病毒检测及疫苗研制的主要靶基因。为了对其进行酵母表面展示，本研究利用本实验室保存的含有ｉＨｎＶ－Ｓｎ１２０３毒株ｇ基因的质粒为模板，ｐｃｒ扩增富含抗原表位的糖蛋白基因片段后，连接酵母表面展示载体ｐ ｙＤ１，构建重组质粒ｐ ｙＤ１－ｇ。将ｐ ｙＤ１－ｇ转化酿酒酵母ｅＢｙ１００细胞后，利用半乳糖诱导ｇ蛋白的表达。利用细胞免疫荧光、ＷｅＳｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ及流式细胞仪检测酵母表面ｇ蛋白的表达情况。细胞免疫荧光结果显示，转化了ｐ ｙＤ１－ｇ重组质粒的酵母细胞表面呈现出特异性荧光；ＷｅＳｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
何琦瑶 魏文燕 汪开毓 刘家星
为研究传染性造血器官坏死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)表面糖蛋白(glycoprotein, G)基因核酸疫苗对虹鳟免疫保护效果及血液生化指标的影响,将IHNV G基因克隆至pMD19-T载体中,连接产物在DH5α中进行转化,获取重组质粒pMD19-TG后回收G基因片段。将鉴定正确的G基因片段利用Bam H I和Xho I酶切位点克隆在真核表达载体pVAX1上,构建核酸疫苗pVAX1-G。重组质粒pVAX1-G按照8μg/尾的剂量注射虹鳟设为pVAX1-G组,同时设8μg/尾空质粒组、PBS对照组和空白组,于免疫后21 d,以100倍半数组织培养感染剂量(tissue culture infective dose, TCID50)通过腹腔注射的方式进行攻毒实验,计算核酸疫苗相对保护率(relative percent survival, RPS),攻毒后收集免疫虹鳟血清进行血液指标检测。结果显示,攻毒后虹鳟血清中16项指标中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、总胆汁酸(TBA)、葡萄糖(GLU)、尿素(Urea)、肌酐(CREA)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和球蛋白(GLO)与正常虹鳟相比有显著变化,空载组11项指标较pVAX1-G组变化显著;攻毒后14 d pVAX1-G组累积死亡率为19%(19/100),而空载组和PBS对照组分别为62%(62/100)和85%(85/100)。pVAX1-G核酸疫苗对虹鳟免疫保护率为78%。病理学观察发现,免疫pVAX1-G组虹鳟的肝脏、脾脏、肾脏组织未见明显损伤。综上表明,pVAX1-G作为核酸疫苗有助于减轻IHNV对虹鳟的损伤,对IHNV有较好的免疫保护效果。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
徐黎明 刘红柏 尹家胜 卢彤岩
利用鲤(Cyprinus carpio)上皮细胞(epitheliaoma papulosum cyprini,EPC)培养传染性造血器官坏死病毒-Sn1203分离株(IHNV-Sn1203),根据GenBank中IHNV G蛋白基因开放阅读框(open reading frame,ORF)的序列设计引物(GenBank序列编号AB288207),采用RT-PCR的方法克隆得到IHNV-Sn1203株G蛋白全长ORF,克隆至表达载体pET27b(+)中,构建了pET27-G重组质粒,并进行了测序分析。生物信息学分析结果显示,IHNV-Sn1203株G蛋白基因序列长度为1 527 bp,与韩国株...
[期刊] 水产学报
[作者]
王树云 高志强 张旻 谷强 任彤 刘艳华 江育林 张利峰
为规避活病毒作参考物质存在的生物安全风险，本研究利用毕赤酵母表达系统表达了传染性造血器官坏死病病毒（ＩＨＮＶ）的糖蛋白来制备参考蛋白，作为ＩＨＮＶ免疫学检测参考物质。本研究选用ＩＨＮＶ糖蛋白基因（ＩＨＮＶ－Ｇ）为目的基因，根据ＧｅＮ ＢａＮｋ中ＩＨＮＶ全基因序列设计特异性引物，以ＩＨＮＶ－ｕｋ株病毒核酸为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ获得糖蛋白基因片段，将其克隆至真核表达载体Ｐ ＰＩＣＺαａ，转入毕赤酵母感受态细胞ＧＳ１１５中，使外源基因与酵母基因融合，通过１％甲醇诱导表达外源蛋白，ＳＤＳ－ＰａＧｅ分析显示获得可溶性表达蛋白，分子量大于７０ ｋｕ。经ＷｅＳＴｅＲＮ ＢｌｏＴ和ｅｌＩＳａ分析，该表达产物．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
连科迅 赵丽丽 张琳琳 贾鹏 唐立杰 葛俊伟 李一经 刘敏
为制备抗IPNV VP2蛋白的单克隆抗体,对其基本特性进行鉴定并进行初步应用。实验利用Ni-NTA亲和层析纯化的IPNV VP2 COE重组蛋白作为免疫原,免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合。采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞,共得到2株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株,分别命名为5G10和5F3,亚类鉴定均为IgG1亚类。2株杂交瘤细胞的染色体数目在75～120之间。间接ELISA检测5G10和5F3细胞培养上清的效价分别为1∶105、1∶102,腹水效价分别为1∶108、1∶104。Western-blotting和间接免...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
吉尚雷 张培军 卢玉婷 王建超 李月红
【目的】克隆传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)CJ-13株糖蛋白(G蛋白)基因,构建原核表达载体,并检测其在大肠杆菌BL21中的表达情况,为IHNV诊断试剂盒和疫苗的研制奠定基础。【方法】设计1对G基因特异引物对G基因进行RT-PCR扩增,将扩增产物克隆到pGEM-T Easy载体上,构建重组质粒pGEM-T Easy-G,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将G基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,构建传染性造血器官坏死病病毒G基因原核表达质粒pET-32a-G,转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法对表达产物进行分...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
刘立月 刘巍巍 赵丽丽 葛俊伟 唐立杰 刘敏 李一经
利用纯化后的传染性胰腺坏死病毒(IPNV VP3)重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞,利用染色体鉴定、蛋白印迹和免疫荧光等方法对单克隆抗体进行鉴定,共得到2株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株,分别命名为2F1、4A7,亚类鉴定2株单抗均为IgG1亚类。ELISA检测其腹水效价,蛋白印迹检测表明获得的2株单抗均能特异性识别IPNV VP3蛋白;间接免疫荧光鉴定表明2株单抗均与IPNV发生反应;间接ELISA检测结果表明2株单抗均不与HSV、SVCV、HRV等病毒反应,与IPNV具有较强的特异性反应。
[期刊] 水产学报
[作者]
付小哲 李宁求 林强 刘礼辉 吴淑勤
为了建立鳜传染性脾肾坏死病毒（ＩＳＫＮＶ）疫苗抗原含量的ＥＬＩＳＡ检测方法，制备了３株抗ＩＳＫＮＶ主衣壳蛋白（ＭＣＰ）的单克隆抗体，鉴定了其生物学特性。将大肠杆菌表达的重组ＭＣＰ纯化复性后，连续３次免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，然后将免疫小鼠的脾细胞与ＳＰ２／０细胞融合，经过克隆、筛选，获得３株能稳定分泌抗ＩＳＫＮＶ ＭＣＰ蛋白的单克隆抗体阳性细胞株，分别命名为５Ｆ１、３Ｄ９和５Ｂ４，均为Ｉｇ ｇ１亚型。间接ＥＬＩＳＡ实验表明，３株单抗可特异性识别ＩＳＫＮＶ，与鳜弹状病毒、大鲵虹彩病毒等无交叉反应。将５Ｆ１株免疫小鼠后制备腹水，以重组ＭＣＰ和ＩＳＫＮＶ细胞培养物上清液为检测抗原，ＥＬＩＳＡ检测腹水效价．．．
[期刊] 淡水渔业
[作者]
陶健 徐黎明 刘淼 赵景壮 曹永生 卢彤岩 尹家胜 刘红柏
以传染性造血器官坏死病毒Sn1203株(IHNV-Sn1203)基因组RNA提取物为模板,利用生物信息学软件分析,通过RT-PCR一步法扩增截短的G蛋白基因序列(约375 bp),将其克隆到表达载体p ET-27b中,构建重组表达质粒p ET-27b-IHNV-short G,通过大肠杆菌Rosetta表达菌株获得高效表达。在IPTG浓度为0.25 mmol/L时,37℃诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析显示目的蛋白相对分子质量约为14 000,符合预期大小,并以包涵体的形式表达,4 h时目的蛋白表达量最大。蛋白经变性、复性处理后获得不带任何标签的纯化蛋白,并利用该蛋白制备兔抗血清。ELIS...
[期刊] 水产学报
[作者]
徐黎明 刘洪柏 卢彤岩
基质蛋白(matrix protein,M)是传染性造血器官坏死病毒(infectious haematopoieticnecrosis virus,IHNV)主要结构蛋白之一,是病毒感染后造成细胞凋亡的主要作用蛋白。为分析IHNV M蛋白的序列及结构特征,研究利用敏感细胞(EPC)培养传染性造血器官坏死病毒-Sn分离株(IHNV-Sn),根据M蛋白基因开放阅读框(open reading frame,ORF)的序列设计引物,利用RT-PCR的方法克隆得到M蛋白全长ORF,并且构建至表达载体pET27b(+)中,构建出pET27-M重组质粒。生物信息学分析结果显示,M蛋白基因的序列长度为588...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
赵永欣 赵丽丽 刘巍巍 王建楠 李一经 乔薪瑗 葛俊伟 刘敏
应用RT-PCR方法扩增了长度为1176 bp的IHNV-ZYX株编码核衣壳(N)蛋白基因,将N基因克隆至原核表达载体pET30b,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中得到了表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了预期大小约48 KD的N蛋白,与理论值相符;提取N蛋白的包涵体,并制备抗血清。间接ELISA和Western-blot-ting实验结果说明,表达的N蛋白与天然的IHNV N蛋白一样具有相同的抗原性。本试验结果为进一步研究分离株IHNV-ZYX N基因的免疫功能,建立灵敏高效的检测传染性造血组织坏死病的方法和研制基因工程疫苗奠定了重要的物质基础。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
何亚鹏 陈怡静 时晓 张宝莉 温战华 陈春山 李博 杜迎春
实验建立了一套反转录环介导等温扩增方法(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP),用于实验室及现场检测鲑鳟鱼传染性造血器官坏死病毒(infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)。针对IHNV的核蛋白基因设计特异性引物,以IHNV基因组RNA为模板,在反转录酶及Bst DNA聚合酶的作用下进行反转录LAMP,结果阳性样本表现为荧光绿色,阴性样本仍为红棕色。反应条件优化结果表明最适反应温度为64℃;特异性试验表明仅IHNV发生特异性扩增,而SVCV、HRV、VHSV和H_2O均不发生反应;敏感性试验表明该LAMP方法可检出浓度为1.0×10~(-4)μg/μL的IHNV核酸。本研究所建立的IHNV反转录LAMP检测法成本低、操作简单、反应迅速、不依赖专门的仪器,同时具有较高的灵敏度和特异性,适合IHNV的现场检测和大批量样品的检疫。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘淼 徐黎明 卢彤岩 赵景壮 曹永生 刘红柏 尹家胜 张金凤 冯剑
将逆转录环介导的等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)引入到鱼类的传染性造血器官坏死病病毒(infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)检测中,建立了简单、快速、灵敏的IHNV检测方法。针对IHNV的聚合酶蛋白基因(polymerase protein,L)设计特异性引物,以IHNV基因组RNA为模板,在反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下进行RT-LAMP,反应产物添加SYBR Green I荧光染料后,肉眼观察阳性样本表现为荧光...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
杨冰 黄倢 宋晓玲 史成银 刘莉 刘庆慧
利用非放射性标记物地高辛(DIG),通过PCR方法制备了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)DNA探针,探针长度705bp,标记产量为20ng/μL。通过核酸探针斑点杂交检测方法对此探针特异性及灵敏度进行验证,结果表明,该探针具有较高的灵敏度和较强的特异性,检测IHHNVDNA的检出灵敏度为24.8pg,可检出26.6ng患病对虾组织DNA中的IHHNV,与250.4ng健康虾组织DNA、202.5ng健康虾匀浆液,白斑综合症病毒(WSSV)DNA和肝胰腺细小病毒(HPV)DNA均不发生交叉反应。本方法可应用于健康亲虾、苗种的培育和无特定病原(SPF)对虾种群的选育及IHHNV流行病...
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