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[期刊] 淡水渔业
[作者]
刘巍巍 赵丽丽 赵永欣 王健楠 李一经 葛俊伟 乔薪瑗 刘敏
采用PCR方法克隆了传染性胰腺坏死病毒(IPNV)VP3四段相互重叠的基因片段L1、L2、L3和L4,将PCR产物分别连接到原核表达载体pGEX-6P1和pET32a上,经酶切、PCR、测序鉴定,获得重组质粒pGEX-6P1-VP3(L1)、pET32a-VP3(L2)、pGEX-6P1-VP3(L3)和pGEX-6P1-VP3(L4);将其分别转化感受态菌Rosetta和BL21,经1.0mmol/L的IPTG诱导,分别得到大小为32 kD、26 kD、30 kD和31 kD的目的蛋白。经Western-blo-ting分析,4段目的蛋白中,只有VP3(L1)和VP3(L4)基因片段所表达的...
[期刊] 水产学报
[作者]
赵丽丽 刘敏 哈卓 刘巍巍 赵永欣 葛俊伟 乔薪瑗 李一经
应用RT-PCR方法扩增了IPNV编码内衣壳VP3蛋白的基因615bp,将VP3基因克隆至原核表达载体pET30b,并在大肠杆菌BL21中得到了表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了预期大小约30ku的VP3蛋白,与理论值相符,经薄层扫描分析表明目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的30%。用镍离子亲和层析柱纯化可溶性的VP3蛋白,并制备抗血清。Western-blotting结果显示,VP3蛋白可被兔抗IPNV阳性血清识别;间接ELISA结果显示,IPNV细胞培养物作为抗原,兔抗VP3蛋白高免血清稀释度为1∶25600时,P/N>2,抗血清可与IPNV全病毒发生反应,以上两项结果说明...
[期刊] 水产学报
[作者]
王健楠 赵丽丽 刘立月 连科迅 李一经 葛俊伟 刘敏
利用RT-PCR方法扩增出IPNV-ZYX分离株主要结构蛋白VP2的抗原表位区基因(616bp),命名为IPNV VP2 COE,将其克隆到pCold TF表达载体中构建重组质粒pCold TF-VP2COE,在大肠杆菌BL21(DH5α)感受态表达,经SDS-PAGE电泳分析,表达蛋白约78 ku,用镍离子亲和层析柱纯化该蛋白,制备抗血清,间接ELISA结果显示,IPNV(ATCC VR-1318)细胞培养物与鼠抗VP2 COE蛋白血清发生特异性反应,效价为1∶12 800;间接免疫荧光结果显示,鼠抗VP2 COE血清可与黑龙江某渔场已知感染IPNV虹鳟肝组织产生特异性的荧光,以上两项结果表...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
刘敏 赵丽丽 葛俊伟 欧笛 王相清 刘弈 张伟 李一经
根据传染性胰腺坏死病毒(IPNV)VP3蛋白的全基因序列,设计并合成引物,以IPNV(ATCC VR-1318)细胞培养毒提取的核酸为模板,对传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的干酪乳杆菌表达系统进行了构建研究。结果显示:进行RT-PCR扩增得到截短的VP3基因约615 bp目的片段,将其克隆到pMD18-T Simple载体,经酶切、PCR扩增和序列测定后显示目的片段正确;将目的片段分别亚克隆到乳酸菌细胞表面表达型载体和分泌表达型载体,电转化于干酪乳杆菌,获得了阳性重组菌株。结果表明,通过本实验方法可构建表达传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的干酪乳杆菌表达系统,为实现IPNV VP3蛋白在乳酸菌中的表...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
陶健 徐黎明 刘淼 赵景壮 曹永生 卢彤岩 尹家胜 刘红柏
以传染性造血器官坏死病毒Sn1203株(IHNV-Sn1203)基因组RNA提取物为模板,利用生物信息学软件分析,通过RT-PCR一步法扩增截短的G蛋白基因序列(约375 bp),将其克隆到表达载体p ET-27b中,构建重组表达质粒p ET-27b-IHNV-short G,通过大肠杆菌Rosetta表达菌株获得高效表达。在IPTG浓度为0.25 mmol/L时,37℃诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析显示目的蛋白相对分子质量约为14 000,符合预期大小,并以包涵体的形式表达,4 h时目的蛋白表达量最大。蛋白经变性、复性处理后获得不带任何标签的纯化蛋白,并利用该蛋白制备兔抗血清。ELIS...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
刘立月 刘巍巍 赵丽丽 葛俊伟 唐立杰 刘敏 李一经
利用纯化后的传染性胰腺坏死病毒(IPNV VP3)重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞,利用染色体鉴定、蛋白印迹和免疫荧光等方法对单克隆抗体进行鉴定,共得到2株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株,分别命名为2F1、4A7,亚类鉴定2株单抗均为IgG1亚类。ELISA检测其腹水效价,蛋白印迹检测表明获得的2株单抗均能特异性识别IPNV VP3蛋白;间接免疫荧光鉴定表明2株单抗均与IPNV发生反应;间接ELISA检测结果表明2株单抗均不与HSV、SVCV、HRV等病毒反应,与IPNV具有较强的特异性反应。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
赵永欣 赵丽丽 刘巍巍 王建楠 李一经 乔薪瑗 葛俊伟 刘敏
应用RT-PCR方法扩增了长度为1176 bp的IHNV-ZYX株编码核衣壳(N)蛋白基因,将N基因克隆至原核表达载体pET30b,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中得到了表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了预期大小约48 KD的N蛋白,与理论值相符;提取N蛋白的包涵体,并制备抗血清。间接ELISA和Western-blot-ting实验结果说明,表达的N蛋白与天然的IHNV N蛋白一样具有相同的抗原性。本试验结果为进一步研究分离株IHNV-ZYX N基因的免疫功能,建立灵敏高效的检测传染性造血组织坏死病的方法和研制基因工程疫苗奠定了重要的物质基础。
[期刊] 水产学报
[作者]
李秋璇 费荣梅
为探究本实验室分离的传染性皮下及造血组织坏死病毒NJ株(IHHNV-NJ)ORF3基因编码蛋白的结构特征,本实验根据ORF3基因序列设计引物,利用PCR方法克隆ORF3基因序列,并构建至原核表达载体p ET-32a(+)中。对成功构建的p ET32a-ORF3重组表达载体进行原核表达,获得49 ku的融合蛋白,符合预期大小。通过生物信息学软件对ORF3基因编码蛋白序列进行分析,结果显示,ORF3基因序列长度为990 bp,编码329个氨基酸;ORF3基因编码蛋白理论分子质量为37 385.2 u,等电点为7.22,为亲水性蛋白;该编码蛋白序列不存在跨膜区、信号肽切割位点;二级结构含有55.9%...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
付小哲 李宁求 彭媛媛 林强 石存斌 黄志斌 吴淑勤
从患传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)病的鳜体内获得ORF093基因。采用PCR方法扩增ISKNV ORF093基因全长,克隆入原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导表达,Ni柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备兔抗重组093蛋白血清,免疫印记分析兔抗血清的特异性,中和实验和免疫保护实验分析重组093蛋白的免疫原性。结果显示:ISKNV重组093蛋白可以在大肠杆菌中以包涵体形式存在;制备的兔抗血清可以特异性识别重组093蛋白,对ISKNV具有中和作用,可给鱼体提供至少10 d的100%预防保护;重组093蛋白...
[期刊] 水产学报
[作者]
连科迅 赵丽丽 张琳琳 贾鹏 唐立杰 葛俊伟 李一经 刘敏
为制备抗IPNV VP2蛋白的单克隆抗体,对其基本特性进行鉴定并进行初步应用。实验利用Ni-NTA亲和层析纯化的IPNV VP2 COE重组蛋白作为免疫原,免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合。采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞,共得到2株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株,分别命名为5G10和5F3,亚类鉴定均为IgG1亚类。2株杂交瘤细胞的染色体数目在75～120之间。间接ELISA检测5G10和5F3细胞培养上清的效价分别为1∶105、1∶102,腹水效价分别为1∶108、1∶104。Western-blotting和间接免...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
王会英 蒋烨 赵丽丽 唐丽杰 乔薪瑗 姜艳平 崔文 李一经 刘敏
为构建传染性造血器官坏死病毒（ＩＨＮＶ ＨＬＪ－０９）微型基因组并表达虹鳟ＩＦＮ，采用ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＩＨＮＶ ＨＬＪ－０９株的Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｇ和ＮＶ蛋白基因并亚克隆入真核表达载体ＰＣＩ中，构建辅助质粒ＰＣＩ－Ｎ、ＰＣＩ－Ｐ、ＰＣＩ－Ｌ、ＰＣＩ－Ｇ和ＰＣＩ－ＮＶ；将扩增获得的ＩＨＮＶ基因组两末端序列、增强型绿色荧光蛋白（ＥＧＦＰ）报告基因、虹鳟Ｉ型干扰素（ＩＦＮ）基因克隆到真核表达载体ＰＣＩ中构建出表达ＥＧＦＰ的ＩＨＮＶ微型基因组ＰＣＩ－ＬＦＧＴ和表达ＩＦＮ的ＩＨＮＶ微型基因组ＰＣＩ－ＬＦＩＴ；将ＰＣＩ－ＬＦＩＴ质粒转染已接种ＩＨＮＶ ＨＬＪ－０９毒株的ＥＰＣ细胞，实时荧光定量ＰＣＲ法测定细胞中．．．
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王庆 罗永文 刘春 曾伟伟 张超 石存斌 吴淑勤
鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)全基因组序列于2001年完成测定,全基因组为111362bp,含有124个推测的开放阅读框(ORF)。2007年,Eaton等对12株已完成序列测定的虹彩病毒代表株进行分析比较,除了已经推测的ORF外,认为ISKNV基因组中还存在一个的核心基因(Core gene)ORF90.5L。本研究以ISKNV的cDNA为模板,根据Eaton等报道中推测的上下游位点设计引物扩增出一段963bp的PCR产物。该序列编码一个320个氨基酸的蛋白质,推测分子量为35kD,含有预测的跨膜区,...
[期刊] 水产学报
[作者]
翁少萍 邓敏 何建国 吕玲 何华虹 龙綮新
测定了鳜传染性脾肾坏死病毒 (ISKNV)核糖核酸酶III(RNaseIII)基因的核苷酸全序列。该基因完整读码框为 771bp ,GC含量为 5 2 .5 3% ,编码一个长为 2 5 6个氨基酸、分子量为 2 8.9kD的推定蛋白。其上下游序列各有一个TATAbox ,终止子下游有一段回文序列。与其它物种相比 ,ISKNV与虹彩病毒 (包括LCDV - 1和CIV)的核糖核酸酶III基因的氨基酸序列同源性较高 ,与酵母、线虫等物种的相应基因的同源性较低
[期刊] 水产学报
[作者]
邓敏 何建国 翁少萍 吕玲 何华虹 龙綮新
报道了鳜传染性脾肾坏死病毒 (ISKNV)的p31基因结构及其序列分析。对ISKNVDNAHindIIIE酶切片段的序列分析结果发现该序列中含有完整的p31基因。ISKNVp31基因完整读码框为 6 75bp ,GC含量为 4 9.78% ,等电点为 7.6 1,编码一个长为 2 2 5aa、分子量为 2 5 .3kD的推定蛋白。结构分析发现该基因具有启动子元件TATAbox和CAATmotif,下游有反向重复序列可形成茎环 ,另外还有一段直接重复序列和二联体结构。ISKNV与其它 3种虹彩病毒 (包括FV3、LCDV - 1和EHNV)的p31基因氨基酸序列具有一定的同源性 ,但ISKNV与...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘荭 范万红 史秀杰 陈超 吕建强 何俊强 高隆英 江育林
用传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的反转录聚合酶链及该方法在来自国内养殖场的患病牙鲆和虹鳟及进口的匙吻鲟鱼卵中检测出IHNV,同时对扩增出的IHNV的DNA片段进行了序列分析。结果表明,从国内养殖的牙鲆和虹鳟中分离出的IHNV与IHNV的标准株RB-1株在序列上都具有98.1%的同源性,推导出在氨基酸序列上分别具有97%和99%的同源性。从进口匙吻鲟鱼卵中分离的IHNV与RB-1株在序列上都具有92.5%的同源性,推导出氨基酸序列有93%的同源性。系统发育树分析结果表明,从国内发病的养殖虹鳟中分离出的IHNV与进口匙吻鲟鱼卵中检测到的IHNV在进化上关系较为密切。
关键词：
传染性造血器官坏死病毒 检测 基因分析
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