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[期刊] 渔业科学进展
[作者]
闫冬春 陈博堃
传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)是一种分布较广、危害较大的对虾病毒,已被世界动物卫生组织(OIE)列为须向其申报的甲壳类重要疫病病原。IHHNV在我国已形成了一定的流行趋势,目前仍是严重危害我国养殖虾类的重要病毒。本文从IHHNV的流行地区及危害、宿主、致病类型、对宿主不同年龄阶段的致病性差异、与白斑综合征病毒(WSSV)的干扰作用、感染机制和致病机理方面,综述了与IHHNV致病性相关的研究进展,以期为进一步深入研究IHHNV防控提供参考资料。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
杨冰 宋晓玲 黄倢 雷质文
对虾传染性皮下及造血组织坏死病(IHHN)是国际兽疫局(OIE)划定的甲壳类其他重要疾病之一,它分布广泛,危害严重,对世界对虾养殖业的发展影响重大。随着国际贸易的不断发展,区域间个体的流动有可能造成该病病毒传播。有迹象表明,近几年来中国养殖对虾中已发现IHHNV,且呈流行趋势。目前,国际上已建立起多种标准检测方法以监控疾病的流行。本文就该病毒的病毒特性、感染宿主、传播途径、地理分布及诊断技术等方面的研究现状作一综述,旨为对虾病毒性流行病学调查及疾病监控提供参考。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
连新宇 王秀华 李晨 张庆利 苟紫玥 吕若萱 杨冰
传染性皮下和造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus， IHHNV)是危害虾类健康养殖的重要病原，为寻找一种快捷保存及分离IHHNV DNA的方法，为后续研究提供完整的核酸材料，选用FTA (flinders technology associates)卡为保存介质，以FTA纯化试剂、TE (Tris-EDTA)缓冲液及去离子水为基础洗脱液，设计了7种FTA卡黏附DNA洗脱方法，通过荧光定量PCR检测方法检验不同核酸洗脱分离效果及最低的点膜核酸量。结果显示，于4 mm~(2)的FTA卡上，点样体积为2.5 μL，用洗脱液作为模板时，最低点膜核酸浓度需要1.47×10~(4) copies/μL以上，可获得最佳的检测灵敏度和100%检出率的洗膜方法为50 μL TE缓冲液于95 ℃下浸洗5 min；用膜片做模板，点膜核酸浓度需要1.82×10~(3) copies/μL以上，室温(20～25 ℃)下用FTA纯化试剂洗脱3次，再用TE缓冲液洗脱2次，洗脱时间均为5 min，可获得最佳的检测灵敏度和100%的准确度。以FTA卡保存对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus， WSSV)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei， EHP)、虾十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1， DIV1)、偷死野田村病毒(covert mortality noda virus， CMNV)、致急性肝胰腺坏死副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus， V_(pAHPND))核酸，测试所建洗脱方法的效果，证实了该方法对其他虾类病原核酸的洗脱具有通用性。该研究给出了FTA卡保存和洗脱IHHNV DNA的适用性方案，为野外对虾样品采集、病毒核酸样品跨区域传递的保存和运输条件提供了科学数据。
关键词：
IHHNV FTA卡 洗脱方法 优化
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
杨冰 宋晓玲 黄倢 史成银 刘莉 刘庆慧 宋微波
对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)病是国际兽疫局(OIE)划定的甲壳类其他重要疾病之一,它分布较广,危害严重,对世界对虾养殖业发展影响重大。本文根据Genbank登录的IHHNV基因序列(AF218266),设计了1对特异性引物,从纯化的IHHNV DNA和感染IHHNV凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)组织DNA中成功地扩增出产物大小为703bp的DNA片段,该对引物对IHHNV DNA的检测灵敏度为19. 85fg(8. 83×103 病毒拷贝),与健康对虾组织DNA、对虾白斑综合征病毒(WSSV) DNA及对虾肝胰腺细小病毒(HPV) DNA无交叉反应。本...
[期刊] 水产学报
[作者]
徐黎明 刘淼 曾令兵 赵景壮 曹永生 尹家胜 刘红柏 卢彤岩
为了对分离于山东某虹鳟养殖场的一株传染性造血器官坏死病毒株(IHNV-Sn1203)进行致病性检测与研究,将该IHNV-Sn1203毒株进行虹鳟鱼苗人工回接感染实验。结果显示,8d内人工感染实验鱼累计死亡率高达100%。收集大批濒死的病鱼样本,制备病理组织切片;利用鲤上皮细胞(EPC)进行细胞感染实验、病毒电镜观察、空斑实验、病毒滴度检测和聚类分析。病理组织切片显示,该病毒可造成虹鳟造血器官广泛性坏死;细胞感染实验结果显示,接种24 h后EPC细胞出现葡萄串状典型细胞病变(cytopathic effect,CPE),72 h后大部分细胞崩解脱落形成网状孔洞;电镜下清晰可见弹状病毒粒子大量存在...
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
周优 岳志芹 梁成珠 徐彪 朱来华 高宏伟 孙敏 刘荭 汪东风
对虾传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)可感染世界各地养殖对虾,给对虾养殖业造成严重经济损失。本实验首次采用实时定量PCR法对广西地区的84份凡纳滨对虾样品进行检测,同时以常规PCR检测作对照。实时定量PCR检测阳性率为79·8%,常规PCR检测阳性率为40·5%,表明广西地区养殖的凡纳滨对虾IHHNV的感染率较高。将二者检测均呈阳性的30份样品扩增产物进行序列分析测序,测序结果通过DNA STAR软件包进行分析,并通过NCBI Blast与GenBank中的序列进行比对。结果证明,测定的是IHHNV序列。30份样品的IHHNV序列很保守,可以分为4种类型,仅有两个碱基的位置发生变异。实...
[期刊] 水产学报
[作者]
刘荭 高隆英 史秀杰 江育林
A reverse transcription polymerase chain reaction (RT PCR) was used for detection of infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) from the gills and subcutaneous tissue of Penaeus vannamei (10-15cm in body size) without clinical signs. With primers 77012R and 77353F, a fragment o...
[期刊] 水产学报
[作者]
李秋璇 费荣梅
为探究本实验室分离的传染性皮下及造血组织坏死病毒NJ株(IHHNV-NJ)ORF3基因编码蛋白的结构特征,本实验根据ORF3基因序列设计引物,利用PCR方法克隆ORF3基因序列,并构建至原核表达载体p ET-32a(+)中。对成功构建的p ET32a-ORF3重组表达载体进行原核表达,获得49 ku的融合蛋白,符合预期大小。通过生物信息学软件对ORF3基因编码蛋白序列进行分析,结果显示,ORF3基因序列长度为990 bp,编码329个氨基酸;ORF3基因编码蛋白理论分子质量为37 385.2 u,等电点为7.22,为亲水性蛋白;该编码蛋白序列不存在跨膜区、信号肽切割位点;二级结构含有55.9%...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
杨冰 黄倢 宋晓玲 史成银 刘莉 刘庆慧
利用非放射性标记物地高辛(DIG),通过PCR方法制备了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)DNA探针,探针长度705bp,标记产量为20ng/μL。通过核酸探针斑点杂交检测方法对此探针特异性及灵敏度进行验证,结果表明,该探针具有较高的灵敏度和较强的特异性,检测IHHNVDNA的检出灵敏度为24.8pg,可检出26.6ng患病对虾组织DNA中的IHHNV,与250.4ng健康虾组织DNA、202.5ng健康虾匀浆液,白斑综合症病毒(WSSV)DNA和肝胰腺细小病毒(HPV)DNA均不发生交叉反应。本方法可应用于健康亲虾、苗种的培育和无特定病原(SPF)对虾种群的选育及IHHNV流行病...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
袁颜颜 杨冰 万晓媛 刘笋 刘天齐 黄倢
利用世界动物卫生组织(OIE)推荐的4对引物(389F/R、392F/R、77012F/77353R和309F/R),通过普通PCR方法,对本实验室2011-2012年采集于国内不同地区的对虾样品进行IHHNV(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus)检测,并对国内存在的IHHNV检出类型进行初步分析。检测结果显示,在凡纳滨对虾、斑节对虾、中国对虾、宽沟对虾中均检测出了IHHNV,而在脊尾白对虾中未检出。其中凡纳滨对虾阳性率最高,中国对虾阳性检测率最低。对虾样品2011年阳性率高于2012年,华东地区高于华北、华南两地。此外...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘宝彬 杨冰 吕秀旺 万晓媛 刘珍 黄倢
[期刊] 水产学报
[作者]
王树云 高志强 张旻 谷强 任彤 刘艳华 江育林 张利峰
为规避活病毒作参考物质存在的生物安全风险，本研究利用毕赤酵母表达系统表达了传染性造血器官坏死病病毒（ＩＨＮＶ）的糖蛋白来制备参考蛋白，作为ＩＨＮＶ免疫学检测参考物质。本研究选用ＩＨＮＶ糖蛋白基因（ＩＨＮＶ－Ｇ）为目的基因，根据ＧｅＮ ＢａＮｋ中ＩＨＮＶ全基因序列设计特异性引物，以ＩＨＮＶ－ｕｋ株病毒核酸为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ获得糖蛋白基因片段，将其克隆至真核表达载体Ｐ ＰＩＣＺαａ，转入毕赤酵母感受态细胞ＧＳ１１５中，使外源基因与酵母基因融合，通过１％甲醇诱导表达外源蛋白，ＳＤＳ－ＰａＧｅ分析显示获得可溶性表达蛋白，分子量大于７０ ｋｕ。经ＷｅＳＴｅＲＮ ＢｌｏＴ和ｅｌＩＳａ分析，该表达产物．．．
[期刊] 淡水渔业
[作者]
何亚鹏 陈怡静 时晓 张宝莉 温战华 陈春山 李博 杜迎春
实验建立了一套反转录环介导等温扩增方法(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP),用于实验室及现场检测鲑鳟鱼传染性造血器官坏死病毒(infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)。针对IHNV的核蛋白基因设计特异性引物,以IHNV基因组RNA为模板,在反转录酶及Bst DNA聚合酶的作用下进行反转录LAMP,结果阳性样本表现为荧光绿色,阴性样本仍为红棕色。反应条件优化结果表明最适反应温度为64℃;特异性试验表明仅IHNV发生特异性扩增,而SVCV、HRV、VHSV和H_2O均不发生反应;敏感性试验表明该LAMP方法可检出浓度为1.0×10~(-4)μg/μL的IHNV核酸。本研究所建立的IHNV反转录LAMP检测法成本低、操作简单、反应迅速、不依赖专门的仪器,同时具有较高的灵敏度和特异性,适合IHNV的现场检测和大批量样品的检疫。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
朱旭 兰文升 刘荭 高隆英 杜鹃 陈孝煊
应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从传染性造血器官坏死病毒(Infectious hemato-poietic necrosis virus,IHNV)感染的细胞悬液克隆病毒的糖蛋白基因,将其亚克隆至原核表达载体pCWori,转化到大肠杆菌DH5α,通过发酵大肠杆菌制备病毒糖蛋白。经SDS-PAGE分析,诱导表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,使用Ni-NTA亲和层析柱在变性条件下进行纯化并透析复性,最终得到了较高纯度的可溶性糖蛋白,分子量约为57kDa。Western-blot分析结果显示,所表达的蛋白能够被IHNV病毒制备的兔抗IHNV血清识别。用复性后的蛋白免疫小鼠制备抗血清,E...
[期刊] 水产学报
[作者]
赵景壮 徐黎明 刘淼 曹永生 尹家胜 刘红柏 卢彤岩
糖蛋白（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｇ）是鱼类传染性造血器官坏死病毒的主要表面抗原，是病毒检测及疫苗研制的主要靶基因。为了对其进行酵母表面展示，本研究利用本实验室保存的含有ｉＨｎＶ－Ｓｎ１２０３毒株ｇ基因的质粒为模板，ｐｃｒ扩增富含抗原表位的糖蛋白基因片段后，连接酵母表面展示载体ｐ ｙＤ１，构建重组质粒ｐ ｙＤ１－ｇ。将ｐ ｙＤ１－ｇ转化酿酒酵母ｅＢｙ１００细胞后，利用半乳糖诱导ｇ蛋白的表达。利用细胞免疫荧光、ＷｅＳｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ及流式细胞仪检测酵母表面ｇ蛋白的表达情况。细胞免疫荧光结果显示，转化了ｐ ｙＤ１－ｇ重组质粒的酵母细胞表面呈现出特异性荧光；ＷｅＳｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ．．．
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