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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王莹 郑浩 何成华 张爱华 张海彬
采用戊二醛(GA)一步法将半抗原伏马菌素B1(FB1)分别与鸡卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备2种具有免疫原性的FB1人工抗原FB1-OVA和FB1-BSA。分别采用凝胶电泳法、紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、基质辅助激光分析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)4种方法鉴定人工抗原偶联效果并测定偶联比。将FB1-BSA作为免疫抗原免疫BALB/c小鼠,FB1-OVA作为固相包被抗原,采用间接酶联免疫吸附法(i-ELISA)测定小鼠抗血清滴度。结果表明:4种方法均鉴定FB1人工抗原合成成功。凝胶电泳法测定FB1-OVA和FB1-BSA相对分子质量分别约为50...
关键词：
伏马菌素B1 人工抗原 偶联比 抗体
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王莹 郑浩 何成华 张爱华 冯璐璐 皇超英 张海彬
【目的】真菌毒素可导致严重的食品安全问题。本试验旨在制备可用于检测伏马菌素B1的特异性单克隆抗体。【方法】制备伏马菌素B1人工抗原,杂交瘤细胞法筛选杂交瘤细胞株制备腹水型单克隆抗体,并对其特性进行鉴定。【结果】筛选得到杂交瘤细胞株F3,分泌的单克隆抗体亚类为IgG1,轻链类型为κ链;10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单抗蛋白重链分子质量约为50 kD,轻链分子质量约为25 kD;间接酶联免疫吸附法测定杂交瘤细胞F3细胞培养上清和腹水效价分别为1:3 200和1:51 200;亲和力常数为1.60×10-8 mol.L-1;IC50值可达3.589ng.mL-1;对其它真菌毒素不存在交叉反应;免疫...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王莹 顾舒舒 何成华 王玉伟 任喆 施志玉 赵士侠 张海彬
从伏马菌素B1(FB1)杂交瘤细胞株F3中扩增出V H和V L基因片段,再经重叠延伸PCR(SOE-PCR)拼接扩增得到单链抗体(ScFv)基因,然后克隆到pCANTAB 5E噬菌粒载体上,转化感受态大肠杆菌TG1,并经辅助噬菌体M13K07超感染,构建FB1毒素噬菌体单链抗体库,ScFv基因插入率为100%,库容约为1.5×107,噬菌体的滴度为2.1×1015PFU·mL-1。免疫亲和筛选和富集后,经ELISA法最终筛选得到5株可分泌阳性噬菌体抗体的细菌。结论:伏马菌素B1噬菌体单链抗体库构建成功。
关键词：
伏马菌素B1 单链抗体 噬菌体抗体库
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵杰 高美须 潘家荣 王志东 兰丽平 睢珂 许舒婷 刘超超 牟慧
【目的】建立一种识别、检测致敏蛋白的新方法。【方法】Pen a 1为虾中主要的致敏蛋白,从其5个主要IgE结合区中选择一段具有代表性的(85—105位)含21个氨基酸的多肽序列,进行化学合成,将多肽分别与匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)偶联,制得免疫原和包被原,免疫原免疫新西兰纯种白兔得到多克隆抗体。以刀额新对虾蛋白、卵清蛋白、花生蛋白和牛奶蛋白为样品,免疫印迹鉴定多克隆抗体对刀额新对虾中Pen a 1蛋白的特异性。【结果】经Ellman试剂测定多肽与KLH、BSA的偶联比分别为12﹕1和8﹕1。间接非竞争ELISA测定多克隆抗体的效价达1.024×106,间接竞争ELISA(i...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
吴贤福 陈溥言 蔡宝祥
马立克氏病病毒(MDV)的分子生物学研究已有20多年的历史,新技术的应用为病毒的分类、疾病的诊断和防治提供了有效的手段。MDV 通过琼脂扩散试验可被分为 A、B、C 三种主要抗原。目前已证明 B 抗原既可引起宿主的体液免疫,又可引起宿主的细胞免疫,是一种重要的中和性抗原。本试验利用提纯的 MDV B 抗原基因的大肠杆菌表达产物制备单克隆抗体,试图为 MDV 亚型的区别和真核生物系统中 B 抗原表达的鉴定提供帮助。
[期刊] 水产学报
[作者]
王丽 桑亚新 周群标 王向红
采用活化酯法将大田软海绵酸(OA)与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联制备免疫抗原(OA-KLH),用还原聚丙烯酰胺凝胶电泳法和红外光谱法对人工抗原的偶联效果进行分析,通过免疫兔子制备抗体,所得抗血清经Protein A凝胶层析柱纯化处理后,用紫外全波长扫描和间接竞争ELISA法验证纯化效果。结果表明,免疫抗原偶联成功并获得了高亲和力的多克隆抗血清,抗血清纯化后浓度为2.16 mg/mL,间接竞争ELISA测定其滴度为12 800、IC15为3.41 ng/mL,为建立快速、经济的检测方法打下了基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
樊海新 李寒松 李复辉 马良友 朱平 吴金节 王希春
[目的]建立用于快速检测伏马菌素B1(FB1)的胶体金免疫层析试纸条。[方法]首先制备了FB1单克隆抗体和FB1-OVA偶联抗原,然后将FB1单克隆抗体与胶体金制成金标抗体包被在金标垫上,将FB1-OVA抗原和羊抗鼠Ig G包被在硝酸纤维素膜(NC膜)表面分别作为检测线和质控线。采用间接竞争法检测待检样品中的FB1与NC膜上的FB1-OVA抗原竞争结合金标抗体中的FB1单克隆抗体情况,并以检测线和质控线显示检测结果。[结果]本试验优化了金标抗体、检测抗原及羊抗鼠Ig G的包被量,检测FB1的灵敏度可达到2 ng·m L-1,最佳判定质量浓度为40 ng·m L-1。[结论]本试验制备的检测试纸...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
沈涛 沈永林 何国声 徐梅倩 顾越星
用大片吸虫分泌排泄 (ES)抗原免疫BALB/c小鼠 ,取其脾细胞与SP2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,经筛选和 3次克隆化培养后获得 2株分泌抗大片吸虫ES抗原单抗的杂交瘤细胞 (F5,F9)。经传代、冻存、复苏培养检测和染色体检查 ,证实其分泌单抗的性质稳定。通过间接ELISA试验证明 ,F5和F9单抗能与大片吸虫、肝片吸虫的ES抗原发生特异性反应 ,而不与它们的虫体抗原反应。SDS PAGE电泳和Western blot显示 ,F5McAb能与ES抗原的相对分子质量为 2 6 0 0 0～ 2 80 0 0的蛋白条带反应 ,而不与其可溶性虫体抗原反应。表明F5McAb有ES抗原特异性 ,是一...
关键词：
大片吸虫 分泌排泄抗原 单克隆抗体
[期刊] 中国农业科学
[作者]
罗利 张静 刘媛 余向阳 马志卿 冯俊涛 刘贤进 张兴
【目的】获得抗川楝素的高灵敏度,高特异性多克隆抗体,建立川楝素的间接竞争酶免疫测定(IC-ELISA)方法。【方法】采用酯化反应合成川楝素的半抗原并经HRMS,NMR及IR鉴定;用混合酸酐法和活化酯法分别合成人工免疫抗原与包被抗原;通过免疫动物获得多克隆抗体。【结果】合成了琥珀酸单酰川楝素(TS)和戊二酸单酰川楝素(TG)2种半抗原,与载体蛋白BSA和OVA分别偶联制备了2种免疫原TS-BSA和TG-BSA,及2种包被原TS-OVA和TG-OVA。免疫后获得的2种抗体效价达6.4×104和3.2×105。经4种不同包被原-抗体组合优化,以(TS-Ab,TG-OVA)组合建立的川楝素IC-ELI...
关键词：
川楝素 半抗原 多克隆抗体 ELISA
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
杨笑笑 杨兴淼 刘亚林 曹瑞兵
[目的]制备日本脑炎病毒prM蛋白的特异性单克隆抗体，对进一步了解prM的结构和功能、开发特异性检测方法以及JEV prM蛋白的功能研究奠定基础。[方法]将prM基因克隆至原核表达载体pET-32a，诱导表达并纯化prM重组蛋白，随后将其免疫小鼠，通过细胞融合和亚克隆得到分泌抗prM单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水并进行效价测定，通过Western blot和IFA验证其特异性，并进行空斑中和试验测定其中和活性，利用原核表达多段截短体蛋白确定单克隆抗体抗原表位并进行保守性分析，将其初步应用于感染检测及亚细胞定位分析。[结果]经细胞融合和三次亚克隆后成功获得1株能稳定分泌抗prM单克隆抗体的细胞株，命名为4H6，所制备的腹水效价可达到1∶1638400，经鉴定该抗体重链属于IgG2b，轻链为κ型。Western blot以及IFA试验均证明该抗体具有良好的特异性。空斑减少中和试验显示4H6不具备中和活性。通过表达截短蛋白鉴定出4H6所识别的抗原表位位于30GENRCWVRAIDVGYMC45，结合生物信息学分析发现该表位位于prM蛋白表面且在JEV不同毒株之间高度保守，有利于抗原抗体的直接接触。并成功将4H6初步应用于JEV感染检测及prM蛋白亚细胞定位分析。[结论] 成功制备1种高效且特异性的JEV prM蛋白单克隆抗体，抗原表位识别区位于pr，为分析prM蛋白在病毒复制过程中的生物学功能以及与其他病毒蛋白（如E蛋白或宿主分子）之间的相互作用提供有效工具。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王雯 佟贺 杨兴淼 曹瑞兵
[目的]本研究旨在制备抗鹅星状病毒（goose astrovirus，GAstV）单克隆抗体，并鉴定其识别的抗原表位，为快速检测GAstV感染和研究P2蛋白的结构与功能奠定基础。[方法]通过原核表达系统表达并纯化GAstV-2 P2蛋白，将其做为免疫原免疫六周龄BALB/c雌鼠，利用杂交瘤技术，经过细胞筛选和亚克隆，获得3株能稳定分泌抗P2蛋白的单克隆抗体，利用Western Blot和间接免疫荧光（IFA）鉴定单抗特异性，用获得的单抗对阴阳性肾脏切片进行免疫组化检测，用间接ELISA测定单抗效价和亚型，同时构建P2蛋白的不同截短体来鉴定得到的单抗识别的抗原表位。[结果]本研究获得三株能稳定分泌抗P2蛋白抗体的杂交瘤细胞，命名为1B10、3C6、5B1。单抗效价分别为1:2048000、1:512000、1:256000，亚型鉴定结果显示，三株单抗的重链均为IgG2b，轻链均为Kappa型。Western Blot和IFA结果显示，三株单抗均可以特异性结合鹅星状病毒，免疫组化结果显示，5B1和3C6可以应用于免疫组化的检测。表位结果显示，1B10识别109TSTTSTGGLITELRN123，3C6识别206LTDPEEDDDPLS217，5B1识别96LNPELETAVLRV107。[结论]本研究成功制备识别不同抗原表位的三株单克隆抗体，为快速检测GAstV感染和研究P2蛋白的结构与功能奠定基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
高履桐 陈翠翠 师宝君 胡兆农
【目的】合成并鉴定杠柳新苷T人工抗原,制备多克隆抗体,为进一步开展杠柳新苷类化合物作用机理的研究奠定基础。【方法】以杠柳新苷T为起始反应物,与丁二酸酐反应生成杠柳新苷T的衍生物(半抗原),采用HPLC-ELSD、MS和NMR对衍生物的结构进行鉴定;将半抗原与载体蛋白(BSA和OVA)进行偶联,采用紫外图谱对人工抗原进行鉴定,并采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)法测定结合比;以乳化的人工抗原免疫8周龄雌性Balb/c小鼠获得杠柳新苷T的多克隆抗体,并测定其效价。【结果】成功合成杠柳新苷T的半抗原和人工抗原,半抗原和载体蛋白(BSA和OVA)的结合比分别为5∶1和7∶1。免疫小鼠后产生针对杠...
关键词：
杠柳新苷T 半抗原 人工抗原 多克隆抗体
[期刊] 中国水产科学
[作者]
冯海洋 邱高峰
从中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)卵巢cDNA中克隆了cyclin B基因的开放阅读框,分别连接到pGEX-2T和pET-32a表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白GST-EsCB和Trx-MrCB。通过优化培养温度、IPTG浓度以及诱导时间,得出重组蛋白的最佳表达条件分别为:0.1 mmol/L IPTG、37℃、4 h和0.1 mmol/L IPTG、30℃、6 h。重组蛋白主要以包涵体形式存在。亲和层析纯化重组蛋白,作为抗原免疫家兔,制备GST-EsCB和Trx-MrCB多克...
[期刊] 华北农学报
[作者]
职爱民 刘庆堂 李青梅 杨苏珍 胡骁飞 柴书军 邓瑞广 张改平
拟合成并鉴定西马特罗(Cimaterol,CIM)人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源CIM多克隆抗血清。通过重氮化方法将西马特罗偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫抗原BSA-CIM和包被抗原OVA-CIM,并采用紫外分光光度法和SDS-PAGE进行了鉴定。结果表明,半抗原CIM和载体蛋白偶联成功。动物免疫试验结果显示,6只小鼠效价均达1×10-3以上,且4号小鼠多抗血清抗CIM的IC50为86.9ng/mL,表明成功获得了高效价、特异性好、亲和力高的的鼠源抗CIM多抗血清。
关键词：
西马特罗 人工抗原 合成 多抗血情
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
胡青松 李吕木 张小飞 许发芝 丁小玲 徐延伟 丁维民
【目的】探讨猪流行性腹泻病毒(PEDV)3种不同抗原制备的卵黄抗体对PEDV的中和能力,为抗猪流行性腹泻卵黄抗体的制备提供新的方法和理论基础。【方法】根据PEDV S糖蛋白基因设计引物扩增PEDVS534基因(636~789位氨基酸)和PEDV COE基因(499~638位氨基酸),并构建原核表达质粒pET32a-PEDV S534和pET32a-COE,分别转化表达菌株BL21(DE3)进行诱导表达。以原核表达的PEDV S534蛋白、COE蛋白以及PEDV灭活病毒为抗原,分别免疫产蛋鸡并制备卵黄抗体,通过病毒中和试验评价各卵黄抗体的中和效力。【结果】成功表达了PEDV S534蛋白和COE...
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