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[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
蔡建平 汪志楷 沈永林 李祥瑞 潘红杰
本试验对伊氏锥虫表面的非变异性蛋白(/抗原)进行初步研究.以磺基琥珀酰-6-(生物素胺)-已酸盐(Sulfosuccinimidyl 6-(biotinamido)hexanoate)对虫体表面蛋白进行生物素标记,超声裂解后经差速离心
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
周勇志 沈杰 周金林 石滨海 王云飞
锥虫的抗原变异非常频繁,阻碍了免疫学防治技术的建立,国内外虽然对此有较多研究报告,但对中国不同地理、宿主株伊氏锥虫表面变异糖蛋白(VSG)分离和特性比较尚无报道,而我国北方新疆骆驼株伊氏锥虫和南方牛、马伊氏锥虫存在来源、地理、宿主和生化特性的差异,因此我们对这两个虫株的 VSG 进行了分离、纯化和特性比较研究,所用虫株来源于新疆骆驼体内、安徽水牛体内.分离后克隆为单一虫株,经小白鼠、大白鼠体内繁殖,鼠血经过 DEAE-52纤维素层析获得纯净锥虫,再经超声裂解,经过两次超速
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
蔡建平 汪志楷 沈永林 李祥瑞 潘红杰
以经生物素标记、Triton X-114相分离、ConA-sepharose 和 Streptavidin-agarose 亲和沉淀抽提、SDS-PAGE 分离并经 wester blotting 鉴定的伊氏锥虫(T.evansi)一种60kD 非变异性表面蛋白质免疫 ICR 小鼠,制备高免血清,用间接免疫荧光技术对该60kD 蛋白的细胞表面分布进行了初步定位研究。结果表明,在同源和异源株虫体表面都有强烈的特异性荧光染色。以该蛋白经直接脾内免疫 ICR 小鼠(总剂量约10μg·鼠~(-1)),可获得对10~2条同源和异源株虫体攻击的部分保护作用,表现为虫血症出现的时间("潜隐期")
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
沈永林 汪志楷 李国清
体外培养后分离出的3个伊氏锥虫变异群体,经环磷酰胺处理大鼠(CY 大鼠)扩增收虫。虫体纯化后超声波裂解,超速离心制成可溶性抗原,经 Sephadex G-50脱盐和 DE-52离子交换层析提纯可变表面糖蛋白(VSG)。经 SDS-PAGE 鉴定,所提纯的3个 VSG 分子量均为40500。用日立835-50型高速氨基酸组成分析仪分析,3个 VSG 均由 Asp,Pro,Thr,Ser,Glu,Gly,Ala,Cys,Val,Met,Ile,Leu,Tyr,Phe,Lys,His,Arg共17种氨基酸组成,但在组成比例上差异明显,尤其表现在 Pro,Met,Leu,Ile.Tyr 和 Clu。经...
关键词：
伊氏锥虫 可变表面糖蛋白 抗原变异
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
蔡建平 汪志楷 沈永林 李祥瑞 潘红杰
以超声波粉碎法裂解纯化的不同地理株伊氏锥虫(T.evansi)单虫克隆群体,提取可溶性蛋白组分,进行 SDS-PAGE 和 Western blotting 分析,结果表明经 SDS-PAGE 分析,不同株 T.evansi 的可溶性蛋白组分中都包括20～30种蛋白成分,相对分子量(Mr)范围大约为7.9～109.5D,主要蛋白成分的 Mr 约为49～66kD 之间,Wertern botting 分析揭示不同株 T.evansi 间有10～20条为特异抗体所识别的抗原组
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张年国 张颖 曲秋芝 孙大江
采用组织匀浆、饱和硫酸铵分步沉淀和Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析的方法提取和纯化施氏鲟卵黄蛋白,并对其性质进行了研究。结果表明:采用50%和70%饱和度的硫酸铵分步沉淀与Sephadex G-100凝胶层析相结合的方法,可以获得一种卵黄蛋白纯品。Native-PAGE和SDS-PAGE分析表明,该纯化蛋白纯度为100%,由一种同源亚基组成,其亚基的相对分子质量约为30 kD。油红O、免疫印迹(Western-blot)和罗丹明B染色均为阳性,表明该蛋白为施氏鲟卵中的一种脂磷蛋白。
关键词：
施氏鲟 卵黄蛋白 分离纯化
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
唐俊 陆娟 许惠芬 陈捷
【目的】对康氏木霉HEX1蛋白进行原核表达和纯化,为进行抗体制备及深入研究HEX1功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增康氏木霉hex1基因,构建pMD19-T-hex1重组克隆质粒,在此基础上构建pET28a-hex1表达载体,转化E.coli BL21(DE3)细胞。通过IPTG诱导表达,对重组HEX1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定。【结果】成功克隆了长660bp的hex1基因并构建了融合表达载体,HEX1蛋白在IPTG诱导下得到表达。融合蛋白主要以包涵体形式存在,能与抗His标签的兔多克隆抗体发生特异性反应,并纯化出了融合表达蛋白。【结论】康氏木霉HEX1蛋白在原核细胞中得到成功...
关键词：
康氏木霉 HEX1 原核表达 蛋白纯化
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
刘倩 唐亮 谈立松 赵玉军
为获得鸡VEGF基因片段,原核表达GST-cVEG基因,并对融合蛋白进行分离纯化,应用RT-PCR从鸡睾丸中扩增出VEGF片段,将PCR产物克隆至pMD 18-T载体。随后,将cVEGF片段亚克隆至带有GST的原核表达载体pGEX-4T-2中,测序鉴定。将重组质粒pGEX4T2-cVEGF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导,并进一步通过Ni-NTA Agarose亲合层析纯化,纯化产物以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,结果表明,成功地构建了原核表达质粒pGEX4T2-cVEGF。GST-cVEGF融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达,Ni-NTA Agarose纯化...
关键词：
cVEGF 融合蛋白 原核表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
祝雯 林志铿 吴祖建 林奇英 谢联辉
采用硫酸铵分级沉淀 ,BlueSepharose 6FastFlow、SPSepharoseFastFlow和HPLC柱层析 ,从河蚬 (Corbiculafluminea)中分离纯化蛋白CFp a。经SDS PAGE测定 ,其分子量为 2 4 .0kD ;经苯酚硫酸法测定 ,其含糖量为 2 .3%。 10～ 16 0 μg/mLCFp a分别处理肝癌细胞BEL74 0 4 72h后 ,采用四氮唑还原法 (MTT)检测癌细胞的生长活性 ,结果显示 ,CFp a对BEL74 0 4癌细胞生长的抑制率在 2 4 .6 %～ 79.2 %。采用质量浓度为 2 0 μg/mL和 4 0 μg/mL的C...
关键词：
河蚬 蛋白纯化 癌细胞 诱导凋亡
[期刊] 中国水产科学
[作者]
江信红 唐云明
黄鳝(MonopterusalbusZuiew)肠道经组织捣碎,正丁醇脱脂,硫酸铵分级沉淀,DEAE Sepharose离子交换层析和SephacrylS 200凝胶过滤,得到蛋白酶纯品。经等电聚焦电泳和SDS PAGE均显示为单一条带。酶的等电点为6 2,最适温度为55℃,最适pH值为10 5,Km(酪蛋白)值为5 5×103mg/L。用SDS PAGE和SephacrylS 200测得其分子量分别为26kD和25 5kD。酶的pH稳定性较好,在pH12时室温保持5h,活力还剩55%。NBS、BrAc、TNBS、PMSF对酶有很强的抑制作用,而PCMB、ME对酶活性影响不大。Ca2+对酶活性...
关键词：
黄鳝 蛋白酶 分离纯化
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张源淑 陈伟华 邹思湘
酪蛋白的胃蛋白酶水解物通过RP-HPLC进行分离,并用NG108-15 细胞对其进行阿片样活性鉴定。实验结果表明:酪蛋白经胃蛋白酶处理2 h 后, 其酶解产物中有阿片样活性物质产生, 而酪蛋白本身无阿片活性。
关键词：
酪蛋白 胃蛋白酶 阿片肽 阿片活性物质
[期刊] 水产学报
[作者]
王海英 薛长湖 孙谧 王跃军 王清印
以大菱鲆肠道为材料,对大菱鲆消化生理中起重要作用的肠蛋白酶的分离纯化条件和理化性质进行了研究。经Tris-HCl缓冲液抽提,硫酸铵分级分离,DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析分离纯化,获得大菱鲆肠蛋白酶Ⅰ的电泳纯制品,并对该酶的性质进行了研究。结果显示:纯酶的分子量约为58kD。纯酶最适反应pH为9.0,最适反应温度50℃;pH稳定范围6.0~11.0,30℃以下酶活性稳定;Mn2+可激活大菱鲆肠蛋白酶Ⅰ,Cu2+、Zn2+、Ag+、Fe3+则对酶活性有抑制作用;巯基蛋白酶抑制剂显著抑制大菱鲆肠蛋白酶Ⅰ的活性,金属蛋白酶抑制剂...
关键词：
大菱鲆 肠蛋白酶 纯化 性质
[期刊] 水产学报
[作者]
吴燕燕 李来好 郝志明 杨贤庆
以罗非鱼肠为原料,采用超声波辅助提取技术、电泳技术和层析技术等对罗非鱼肠道蛋白酶进行研究,结果表明:将鱼肠匀浆经超声波提取的粗酶液,用30%～70%的硫酸铵盐进行盐析、HitrapTM Q FF阴离子交换柱纯化及Sephadex G-100凝胶柱分离纯化,得到罗非鱼肠蛋白酶纯品,其比活为335U/mg,得率为32.8%;SDS-PAGE电泳为单一蛋白酶带,分子量为28ku。该酶最适pH为8.0～8.5,在pH7.0～9.0的条件下稳定;最适温度为37～42℃,热稳定性好;该酶的Km值和Vmax值分别为0.605g/L和9.407μg/min。金属离子Ag+、Pb2+对蛋白酶有完全抑制作用,Na...
关键词：
罗非鱼肠 蛋白酶 纯化 性质
[期刊] 中国农业科学
[作者]
易敏 吕青 刘柯柯 王礼君 吴玉娇 周泽扬 龙梦娴
【目的】微孢子虫是一种细胞内专性寄生的真核生物,几乎能感染所有生物,包括人类。极管作为微孢子虫特有的侵染器官,主要由极管蛋白组成。极管蛋白在微孢子虫侵染宿主与稳定孢子结构中发挥重要作用。本研究通过克隆、表达家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)极管蛋白2(NbPTP2),分析其在成熟孢子极管上的定位特征,为深入研究极管蛋白的功能打下基础。【方法】克隆家蚕微孢子虫NbPTP2。利用Expasy、SignalP 4.1、TMHMM Server V.2.0和NetPhos 3.1 Server等在线软件对NbPTP2的序列特征进行分析,包括氨基酸组成、蛋白质理论分子量、等电点、信号肽、跨膜结构域和磷酸化位点。此外,利用MEGA 7.0软件构建不同种属微孢子虫极管蛋白2的系统进化树。通过克隆NbPTP2,将其与原核表达载体pET32a(+)连接,构建pET32a(+)-NbPTP2重组表达质粒。将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中,IPTG诱导异源表达,经镍柱亲和层析纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用免疫印迹检测NbPTP2在成熟孢子中的表达情况,并通过间接免疫荧光试验(IFA)分析NbPTP2在家蚕微孢子虫成熟孢子中的定位特征。【结果】成功克隆并获得长为834 bp的NbPTP2基因序列,该蛋白编码278个氨基酸残基,理论分子质量为30.9 kD,等电点为9.39,无跨膜结构域,N端存在信号肽,具有潜在的磷酸化修饰位点。系统进化树分析结果显示,家蚕微孢子虫NbPTP2与西方蜜蜂微孢子虫NaPTP2、东方蜜蜂微孢子虫NcPTP2的亲缘关系最近。Western blot结果表明,NbPTP2编码的蛋白质在成熟孢子的孢子总蛋白中有表达,分子量大小约为39 kD。IFA定位特征分析结果显示,NbPTP2能定位于家蚕微孢子虫的整条极管上,证实其为一种极管蛋白。【结论】明确了NbPTP2与其他微孢子虫极管蛋白2的亲缘关系,NbPTP2在成熟家蚕微孢子虫中有表达,且能定位于微孢子虫发芽后的整条极管上。研究结果可为极管的结构解析与极管蛋白功能的研究提供依据。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
崔少勃 丁鲜 张峰
[目的]本文旨在通过建立棉铃虫效应蛋白HARP1体外表达纯化体系，对HARP1蛋白进行体外表达和纯化，为解析HARP1蛋白与植物茉莉酸信号途径中JAZ蛋白的互作分子机制奠定基础。[方法]对harp1基因序列进行密码子优化，使用蛋白预测软件预测HARP1中的信号肽和成熟肽。基于以上信息构建目的蛋白的表达质粒并进行诱导表达，使用亲和层析、酶切、透析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对目的蛋白进行纯化，使用SDS-PAGE和Western blot对蛋白进行分析和检测。[结果]通过优化将harp1基因密码子适应度值(CAI)从0.39提升到0.95。蛋白预测软件预测N末端21个氨基酸为信号肽，信号肽与成熟肽切割位点在第21位丙氨酸和第22位亮氨酸之间，成熟肽为第22位亮氨酸至第122位精氨酸。构建表达质粒pETDuet1-His6-MBP-3C-HARP1(22～122),IPTG能够诱导目的蛋白表达，使用Ni-NTA柱纯化出融合蛋白His6-MBP-3C-HARP1(22～122),3C蛋白酶能够切除His6-MBP标签，使用阴离子交换柱成功分离His6-MBP标签和HARP1(22～122)蛋白，使用Superdex 200 increase Gel Filtration Column进一步纯化获得单体HARP1(22～122)蛋白。[结论]成功建立HARP1蛋白体外表达与纯化体系。
关键词：
棉铃虫 效应蛋白 HARP1 表达 纯化
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