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[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
唐雨德 顾志香 雷永红 翟春生 刘玉 郁兴明
重组蛋白的复性是基因工程下游研究的难题和重点。本文应用夹心 ELISA 测免疫活性及变性与非变性 SDS-PAGE 测重组抗原单体和非单体的方法来评价不同复性条件.透析法复性,透析液为含2mg·kg~(-1)尿素、80μmol/PEG4000,0.1/0.1mmol·L~(-1)GSH/GSSG 的 pH 8.0的0.05mg·kg~(-1)PB,以静置缓慢透析为佳,上述条件任意缺一或快速透析,免疫活性下降,二聚体或多聚体明显增加;稀释法复性,复性液为上
[期刊] 中国农业科学
[作者]
丁军涛 陈晓宇 骆学农 王颖 张少华 刘斌 郑亚东 景志忠 才学鹏
【目的】构建表达猪带绦虫六钩蚴TSOL18抗原的重组鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株。【方法】克隆并改造TSOL18基因,构建重组质粒pYA3341-TSOL18,电转入鼠伤寒沙门氏菌终宿主菌株X4550,体外鉴定重组菌X4550(pYA3341-TSOL18)表达蛋白的免疫原性、稳定性、生长曲线、安全性和小鼠免疫试验进行评价。【结果】酶切鉴定和基因序列测定证实重组质粒构建成功;尿素-SDS-PAGE检测有目的蛋白条带,Western Blot证实该抗原具有免疫原性;重组菌株在体外营养选择压力下可稳定地携带重组质粒传代繁殖;蛋白的表达对重组菌株的生长基本没有影响;小鼠实验证实重组菌安全可靠,二免后E...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘永杰 郝艳红 李庆章
采用 12种培养体系培养猪带绦虫六钩蚴 ,结果发现单层细胞且无气相存在的培养体系效果较好 ,促使大部分六钩蚴进入了六钩蚴后期发育 ,且虫体可延长存活至 16d。
关键词：
猪带绦虫六钩蚴 体外培养 单层细胞
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
邵坤彦 彭宝玉 叶程 刘威 何冬兰
以吸水链霉菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到谷氨酰胺转胺酶基因片段,构建pGEX-TGase重组质粒,并转化到大肠杆菌中得到重组菌BL21/pGEX-TGase。重组菌经乳糖诱导产生融合蛋白,并对诱导条件进行了优化。表达产物主要以包涵体形式存在,采取稀释及尿素梯度液相色谱结合的方法,成功地实现了包涵体蛋白的复性。通过GST亲和柱纯化目的蛋白,得到酶活为29U/mg的电泳纯目的蛋白。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙晓林 才学鹏 米晓云 陈怀涛
【目的】观察猪带绦虫虫卵和六钩蚴膜的超微结构。【方法】猪带绦虫病患者用槟榔、南瓜籽法驱虫,收集成熟虫卵。次氯酸钠法破壳后,等渗percoll溶液收集六钩蚴,人工肠液激活六钩蚴。扫描电镜和透射电镜观察虫卵和六钩蚴。【结果】猪带绦虫成熟虫卵呈卵圆形,直径约为50-58μm,由胚膜、内胞质层、六钩蚴膜和六钩蚴等几部分组成;发育期猪带绦虫六钩蚴的膜结构由外向内分别是外胞膜残留层、外胞质层(包括不规则较致密的外层和均质透明的内层)、胚膜(包括胚层和内胞质层)和六钩蚴膜,而成熟六钩蚴的膜结构仅六钩蚴膜一层,厚度约为49-51nm。【结论】猪带绦虫虫卵和六钩蚴膜的超微结构和缩小膜壳绦虫(Hymenolepi...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张鹏 曹立雪 陈宏 马润林
通过RT-RCR得到线虫f a t-1基因全长,将其N端亲水区克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建重组质粒pGEX-f a t1-N,将其转化大肠杆菌,并进行诱导表达。对表达产物G ST-f a t1-N融合蛋白进行纯化,制备其抗体,并对抗体效价进行了检测。结果表明,线虫f a t-1基因能在大肠杆菌中表达,制备的抗体能识别在原核表达系统内表达的G ST-f a t1-N融合蛋白,且效价很高,达到1∶107。
关键词：
fat-1基因 线虫 原核表达 抗体制备
[期刊] 华北农学报
[作者]
王秋霞 张美英 张改平 王选年 宁长申 鲁琨 张龙现 菅复春
研究了培养基、温度、诱导时间I、PTG和氨苄青霉素终浓度以及诱导前后温度变化等不同条件对重组菌菌体生长和融合蛋白表达量的影响,以期获得猪囊尾蚴排泄分泌抗原(ES Ag)Ts8B1蛋白基因在大肠杆菌中的最大表达量。结果显示,使用TB培养基于37℃培养3 h后,采用终浓度为0.2mmol/L的IPTG和200mmol/L的氨苄青霉素在32℃过夜诱导培养,pGEX-6p-1/Ts8B1融合蛋白表达量最大,表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的33%。SDS-PAGE表明pGEX-6p-1/Ts8B1融合蛋白大小约为33 kDa,与预计的分子量大小一致,Western blot分析表明其能与猪囊尾蚴多克隆抗体...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王瑞琴 杨雄 陈红英
【目的】合成、克隆HIV单克降抗体VRC01的单链抗体基因,在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。【方法】根据GenBank上公布的VRC01抗体可变区的氨基酸序列合成引物,运用基因从头合成和重叠延伸PCR方法,克隆抗体VRC01的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因;用15肽Linker(Gly4Ser)3将VH和VL基因相连,得到单链抗体基因scFv-VH-Linker-VL和scFv-VL-Linker-VH,并分别将两者克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组质粒后转入大肠杆菌BL21(DE3+)中诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析;将重组蛋白进行...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
苗西明 周道金 潘晓条 裴乃亮 彭大忠 李凤英
猪细颈囊尾蚴病由于临床诊断较困难,且没有有效的药物预防和治疗,其危害性容易被人们忽视.这就造成了细颈囊尾蚴病在贵州省流行较广,分布面大,易感动物多,泡状带绦虫贵州省家犬感染率为2.93%,感染强度1～253条,细颈囊尾蚴感染率:猪27.39%,牛1.98%,羊12.1%,兔7.5%;感染强度:猪1～253条、牛1～8条、羊1～30条、兔1～3条.丹寨县家犬泡状带绦虫感染率为23.4%,感染强度1～117
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张磊 唐永凯 李红霞 徐逾鑫 李迎宾 俞菊华
为获得可溶的鲤鱼IL–17N重组蛋白,构建原核重组表达质粒GST–17N、SUMO–GST–17N和MBP–17N,确定IL–17N的最适促溶标签,并优化其诱导表达条件(诱导剂异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)的浓度、诱导时间和诱导温度)。结果:成功构建了鲤鱼IL–17N原核重组表达载体GST–17N、SUMO–GST–17N和MBP–17N;融合标签MBP、SUMO–GST和GST的促溶效果依次降低,SUMO–GST–17N、MBP–17N上清蛋白占总蛋白比例分别为47.4%、87.0%;MBP–17N的最佳表达条件为0.5 mmol/L IPTG,25℃诱导8～12 h;经过镍柱纯化,获得可溶MBP–17N蛋白,每克总菌约获得0.09 mg MBP–17N蛋白。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张劲 郭霭光 丰美福
为了进一步在蛋白质水平对人白细胞抗原HLA-G进行分析,利用已经构建好的克隆质粒pGEM-T-HLA-G1,进一步构建了重组原核表达质粒pET28a-sHLA-G1。SDS-PAGE检测表明,重组蛋白sHLA-G1在大肠杆菌(E.coli)中得到稳定表达,原核表达的重组蛋白sHLA-G1主要以包涵体形式存在。包涵体蛋白经充分洗涤、尿素溶解后用钴离子树脂纯化,并用SDS-PAGE和Western印迹进行了分析,鉴定结果表明,该蛋白纯度达到90%以上,并能与HLA-G特异性抗体87G反应。该研究结果为进一步的复性工作奠定了基础。
关键词：
HLA-G 原核表达 重组蛋白 包涵体
[期刊] 中国农业科学
[作者]
姚静 侯加法 王艳 张风荣
【目的】骨保护素(OPG)是一种新发现能抑制前体破骨细胞分化及成熟破骨细胞活性的蛋白,本文旨在从体外扩增、表达鸡骨保护素(chOPG)蛋白,并制备其多克隆抗体,为深入研究它的生物学功能奠定基础。【方法】以体外培养的鸡胚成骨细胞中提取的总RNA为模板,利用RT-PCR方法,扩增出chOPG基因,测序后克隆至原核表达载体pET-32a(+),成功构建了原核表达质粒pET-32a(+)-OPG,重组质粒转化Rosetta-gami(DE3)pLysS,经IPTG诱导表达。【结果】表达产物经SDS-PAGE电泳,发现目的蛋白大小约为63kD,占菌体总蛋白的11.9%,Western blotting分...
关键词：
鸡 骨保护素 原核表达 纯化 抗体
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
薄慧杰 卢长明 吴刚 武玉花 肖玲 白延红 陈耀锋
通过PCR扩增,从pCAMBIA1300-bar质粒中获得bar基因编码区全长,经酶切鉴定和测序后证实,bar基因分离成功。用BamH和Hind酶切,将bar基因与原核表达载体pET28a(+)连接,构建成重组质粒pET28bar。将重组质粒pET28 bar转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)后,获得高效表达。SDS-PAGE电泳分析显示,目的蛋白主要以包涵体形式存在,蛋白质分子量约为27 ku。将包涵体离心、洗涤和纯化后,得到高纯度的目的蛋白。该蛋白可以替代植物外源蛋白进行转bar基因产品的食用安全性检测,也可用于转bar基因产品ELISA检测的抗体制备。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
韩进欢 苟惠天 尚清炎 孙晓林
【目的】明确重组蛋白pGEX-TPO18的免疫保护效果。【方法】提取豆状带绦虫六钩蚴RNA,根据带科其他种属绦虫18 kD基因的保守区设计引物,5′端分别引入EcoR I、Xho I限制性酶切位点,RT-PCR扩增,产物克隆于pMD18-T中进行序列测定,并对序列进行生物信息学分析。将纯化后的PCR产物和质粒pGEX-4T-1分别用EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切,回收目的片段,连接后转化至E.coli BL21感受态细胞,挑斑摇菌,通过PCR方法和重组质粒测序技术进行鉴定,将鉴定正确的重组表达质粒命名为pGEX-TPO18。用IPTG诱导表达重组质粒,收集菌体进行SDS-PAGE分析,用GST琼脂...
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
张凤雪 徐英武 张智俊 肖冬长 王超莉 屈亚平
3-deoxy-D-manno-octulosonate(KDO)8-phosphate synthase(KDO8PS)[EC 4.1.2.16]是KDO生物合成途径中的关键酶。采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,以毛竹Phyllostachys edulis新鲜实生苗为材料,分离得到竹子KDO8PS基因。通过对不同物种来源的KDO8PS进行氨基酸序列比对分析和半定量RT-PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析。将PeKDO8PS基因构建入原核表达载体pET-28a,并在大肠埃希菌Escherichia coli原核表达系统中获得了KDO8PS的可溶性高表达。经nickel亲和层...
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