【目的】构建一种更具实用性的可定量检测鼠伤寒沙门氏菌的新型电化学适配体传感器,克服传统沙门氏菌检测方法在时效性、灵敏度和操作简便性等方面的不足。【方法】将反应制得的氧化石墨烯(GO)滴涂在玻碳电极(GCE)表面,于PBS缓冲液中采用电化学还原法将其还原为还原氧化石墨烯(r GO),随后放置电极于氯金酸溶液中进行电沉积,于表面修饰一层纳米金(AuNPs)。依靠金硫键的作用将鼠伤寒沙门氏菌适配体互补链(S)固定在电极上,滴加封闭剂巯基己醇(MCH)占据电极表面空余位点,保证电极无非特异性吸附后,再将鼠伤寒沙门

【目的】沙门氏菌是食品中致病菌检测的一项重要指标。本研究拟构建一种实用性更强的用于沙门氏菌检测的新型电化学适配体传感器,以克服各种沙门氏菌传统检测方法的缺陷。【方法】通过混合还原氧化石墨烯(rGO)溶液与甲苯胺蓝(Tb)溶液制得Tb-rGO复合物,再将此复合物分散于纳米金(Au NPs)溶胶中得到Au NPs-Tb-rGO复合物。最后将Au NPs-Tb-rGO复合物与带有氨基的DNA链(S1)孵育得DNA-复合纳米材料(S1-Au NPs-Tb-rGO)。通过金硫键将沙门氏菌适配体互补链(S2)修饰在金

利用增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表征鼠伤寒沙门氏菌株14028(Sal-14028),以研究其在猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)中的示踪作用，首先将增强型绿色荧光蛋白基因通过电击法转入Sal-14028,经卡那霉素抗性培养基筛选和测序鉴定，获得了具有绿色荧光信号的阳性菌株并检测其荧光稳定性，命名为Sal-pPpagC-EGFP。接着在同等条件下对比荧光菌株和野生菌株(WT)的生长特性，通过小鼠感染试验检测EGFP基因的插入对荧光菌株毒力有无明显影响，以分析荧光菌株的生物学特性；应用荧光显微镜和间接免疫荧光法检测荧光菌株在猪肺泡巨噬细胞3D4/21吞噬溶酶体中的定位情况。结果显示，在不同时间点，EGFP标记的鼠伤寒沙门氏菌在荧光显微镜下发出强烈的绿色荧光，且所带荧光不受抗性选择的影响，可稳定遗传。相同培养条件下，荧光菌株Sal-pPpagC-EGFP生长曲线的变化趋势与野生株基本相同。另外，经过改良寇氏法计算出的LD_(50)与野生株相比无显著差异(P>0.05),说明EGFP基因的插入对荧光菌株毒力无明显影响。荧光菌株在感染猪肺泡巨噬细胞后，吞噬溶酶体内可观察到标记菌株，并随着时间增加菌株数量呈现增长趋势。表明荧光菌株除了具备发光特性外，其他生物学性状没有明显改变。

[目的]研究铜绿假单胞菌所产生的群体感应信号分子酰基-高丝氨酸内酯(AHL)对鼠伤寒沙门氏菌生物菌膜形成的影响,为不同菌体间群体感应的研究提供参考,为沙门氏菌的控制提供帮助。[方法]利用薄层层析法分析铜绿假单胞菌所产生AHL的成分,并通过添加0%、1.0%、1.5%、2.0%(体积分数)的AHL来研究其对鼠伤寒沙门氏菌生物菌膜形成、浮游菌体生长以及菌体泳动能力的影响。[结果]铜绿假单胞菌产生2种相同类型的AHL分子(C12-HSL和3-oxo-C8-HSL),100℃加热5 min并不会改变AHL的成分。

通过5′RACE技术分析fadL、ompN、ybfM mRNA的5′UTR,并筛查fadL、ompN、ybfM mRNA 5′UTR中Hfq结合偏好型基序(ARN)n.利用λ-Red同源重组酶和FLP重组酶系统构建fadL、ompN、ybfM基因(ARN)n基序缺失基础上的lacZ基因融合菌株，运用P22噬菌体转导技术构建相应的hfq基因缺失菌株，通过β-半乳糖苷酶试验检测重组菌株的蛋白水平.结果显示，fadL中筛选出ARN-1(AAAAAA)、ARN-2(AAAAATAAT),其缺失降低了fadL的蛋白表达量，分别降低72%、56%;ompN中筛选出ARN-1(GTTTTT)、ARN-2(TCTTTT)、ARN-4(TTTGCT),其缺失提高了ompN的蛋白表达量，分别提高了1.29、1.30、1.07倍，ARN-3(ATTATT)缺失使ompN的蛋白表达量降低了10%;ybfM中筛选出ARN-1(AAGAGG)、ARN-2(AGCAAT)、ARN-3(AGTAAA)、ARN-4(AAAAATAGT)、ARN-5(AACAGAAAG),其缺失均增加了ybfM蛋白水平变化，分别为4.20、3.99、10.90、227.00、46.00倍.结果表明，ybfM、ompN、fadL中(ARN)n位点不同缺失能导致ybfM、ompN、fadL表达水平出现上调或下调，部分(ARN)n序列缺失可影响Hfq对相应靶基因蛋白水平调控作用.

为研究鼠伤寒沙门氏菌感染后不同时间鸡盲肠和脾脏组织TLR4、TLR5、TLR15和TLR21 mRNA的表达规律,选用沙门氏菌阴性济宁百日鸡36只,随机分为2组,饲喂于隔离器中,2日龄分别接种1.23×108cfu鼠伤寒沙门氏菌和PBS溶液,接种后第1、3和7天采集盲肠和脾脏组织样品,应用荧光定量PCR检测感染后各时间、各组织中TLR4、TLR5、TLR15和TLR21的表达量。结果显示,1)济宁百日鸡感染鼠伤寒沙门氏菌后盲肠中TLR4、TLR5、TLR15和TLR21表达量均发生显著变化(P<0.05);2)脾脏中TLR21和TLR4的表达量分别在接种后第1天和第3天显著上调(P<0.05)...

沙门氏菌是人畜共患的重要食源性病原菌,建立灵敏的双重PCR方法有益于实现对致病性沙门氏菌(Sal-monella)的快速检测。以沙门氏菌毒力岛基因为研究对象,根据GenBank发表的沙门氏菌毒力岛基因序列,分别设计合成了沙门氏菌毒力岛mgtC和sopB的2对引物。以鼠伤寒沙门氏菌(ATCC9150)菌株的核酸为模板,经过引物特异性试验,DNA模板灵敏度试验,优化反应条件,成功地建立了快速鉴别以及检测鼠伤寒沙门氏菌的双重PCR方法。特异性试验结果表明,引物mgtC和sopB建立的双重PCR仅能扩增出沙门氏菌(ATCC9150)的2段特异性片段,大小分别是500,1 000 bp。敏感性试验结果表...

[目的]本试验旨在制备抗鼠伤寒沙门菌Pag C蛋白的单克隆抗体并初步分析其特异性和识别的抗原表位,为沙门菌抗体阻断ELISA检测方法的建立奠定基础。[方法]原核表达并纯化Pag C蛋白,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体;用生物信息学分析法获得Pag C蛋白在沙门菌属内保守的区段,合成相应多肽P1及P2用于单克隆抗体筛选和结合表位鉴定;最后采用免疫印迹方法对单克隆抗体与肠杆菌科其他细菌的交叉反应进行检测,评价其特异性。[结果]纯化后的Pag C蛋白相对分子质量约23×103;免疫小鼠后经2次亚克隆最终得到稳定分泌抗体的细胞株6株,标记为A、B、C、D、I、J;单克隆抗体的反应性试验结果显示6株单克隆抗体均能够识别Pag C蛋白;单克隆抗体的结合表位分析显示,J细胞株分泌的单克隆抗体可特异性识别P1序列;采用免疫印迹方法对J细胞株上清液进行特异性检测,证实该株单克隆抗体与变形杆菌、大肠杆菌O1和宋内志贺菌Pag C蛋白均无结合反应。[结论]成功获得1株与Pag C蛋白有良好结合活性且具有高度特异性的单克隆抗体,该株单克隆抗体的识别表位位于Pag C中沙门菌属内保守区段,可作为建立沙门菌抗体阻断ELISA检测方法的候选单克隆抗体。

【目的】通过揭示c-di-GMP通路基因STM2503调控鼠伤寒沙门菌生物被膜形成，进而影响其环境应激能力的机制，以期挖掘调控鼠伤寒沙门菌压力适应性的关键因子，为防控策略的制定提供理论依据。【方法】以λ-Red同源重组方法构建STM2503缺失株，并利用质粒PBAD表达STM2503来构建相应的基因回补株。然后通过检测不同STM2503表达水平菌株中信号分子c-di-GMP的含量揭示STM2503对菌株胞内c-di-GMP水平的影响。接下来，利用细菌运动性检测、结晶紫染色等试验检测了STM2503对菌株运动性和生物被膜形成能力的影响，并利用实时荧光定量PCR从基因层面揭示其对菌株运动性和生物被膜形成的调控机制。最后，通过抗生素处理、氧化应激、消毒剂应激等试验探究了STM2503对鼠伤寒沙门菌压力适应性的影响。【结果】与野生株（WT269）相比，STM2503的缺失使菌株胞内c-di-GMP含量升高了37.51%(P<0.001)，且不影响菌株的正常生长。另外，STM2503的缺失提高了菌株各胞外基质合成基因的表达水平，使缺失株胞外多糖、胞外DNA和胞外蛋白质含量分别增加了10.30%(P<0.01)、33.59%(P<0.001)和27.60%(P<0.01)，最终使菌株的生物被膜形成能力显著增强了1.63倍（P<0.01）。并且，269ΔSTM2503通过降低鞭毛合成相关基因fliA与flhC的表达使其在6 h的运动直径较野生株相比下降了17.22%(P<0.01)。这些变化最终导致269ΔSTM2503菌株对头孢噻肟、头孢吡肟、阿莫西林等β-内酰胺类抗生素的敏感性降低1—3倍，且在氧胁迫和SDS消毒剂胁迫下表现出了更强的适应能力。【结论】STM2503参与信号分子c-di-GMP的降解，并通过抑制胞外基质的合成降低鼠伤寒沙门菌的生物被膜形成能力，通过上调鞭毛合成基因的表达增强菌株的运动性，进而降低菌株的耐药性和环境压力适应能力，本研究为鼠伤寒沙门菌关键防控靶点的挖掘提供了理论基础。

【目的】研制一种能有效指示假阴性的PCR检测产品,用于沙门氏菌快速、准确、灵敏的检测。【方法】针对沙门氏菌invA基因、stn基因序列分别设计引物与扩增内标,建立添加扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法,组装试剂盒,并对试剂盒的各项性能进行评价。【结果】试剂盒对147株沙门氏菌和28株非沙门氏菌的检测结果显示,所有沙门氏菌均能扩增出362 bp的目标条带,非沙门氏菌仅扩增出520 bp的内标条带。试剂盒检测沙门氏菌基因组DNA的检测限为8.0 fg/PCR,检测染菌量为4—5 CFU/10 mL的牛奶样品,增菌8—10 h即得到阳性结果。反复冻融60次或-20℃下贮存1年,均不影响试剂盒的使用效果...

由于食品的多样性和食品基质的复杂性,食品安全问题已成为全社会共同关注的热点问题,其中微生物引起的食源性疾病居全球食品安全问题之首。食源性致病菌的检测是食源性疾病预防与控制的关键环节。平板计数法被评为微生物检测的金标准,但在致病菌检测过程中信号的放大需要通过单个细胞生长成菌落来实现,因此检测周期较长(3—7 d)。此外,现有的准确检测致病菌的技术有聚合酶链式反应(PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)等,但由于预处理时间长、操作复杂、检测结果存在假阳性等问题,不适合对致病菌进行现场快速有效的检测。核酸适配体是利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段,具有良好的特异性、稳定性、易于修饰和亲和力高等特点,在毒素、抗生素、重金属和致病菌等其他小分子的检测中有很大的潜力。目前,国内外学者已开发了各种基于适配体的检测方法。本文综述了食品中常见的食源性致病菌及其传统的检测方法和近十年来用于致病菌检测的光学和电化学适配传感器,涵盖每种方法的检测策略、检测时间、检测范围和检测限等信息,也提出了适配体传感器在食品安全检测中存在的主要问题,并对其未来研究的发展趋势进行了展望,这些将为今后的研究工作提供一定的基础。

【目的】探讨诃子、虎杖、紫花地丁、夏枯草和何首乌提取物对鸡白痢沙门氏菌的抑制效果。【方法】采用超声波处理、乙醇回流、水浴加热的方法,提取诃子、虎杖、紫花地丁、夏枯草、何首乌5味中药的有效成分,采用二倍试管稀释法分别测定各中药提取物对鸡白痢沙门氏菌的最小抑菌质量浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌质量浓度(Minimal bactericidal concentration,MBC),并采用肉汤稀释棋盘法,测定中药提取物对鸡白痢沙门氏菌的联合抑菌效果。【结果】诃子、虎杖、紫花地丁、夏枯草、何首乌提取物对鸡白痢沙门氏菌的MIC、MBC值分别为1...

为探究鼠伤寒沙门菌sRNA STnc1220的分子特征、生物学功能及对细菌毒力的影响，通过PCR扩增了鼠伤寒沙门菌sRNA STnc1220基因，分析了其分子特征，利用TargetRNA2网站预测STnc1220基因可能调控的靶基因；利用λ-Red同源重组技术构建沙门菌(STM)-基因缺失突变株，并与亲本SL1344比较，对其生长特性、生化特性、遗传稳定性、生物被膜(BF)形成能力、在不同应激环境中(pH值、H_2O_2、高盐和乙醇胁迫环境)的适应性、通过黏附侵染巨噬细胞和小鼠感染试验对致病力进行研究。结果显示，STnc1220基因全长73 bp、其上游5′-UTR存在-10和-35启动子结合位点，预测其潜在的靶基因为barA基因；试验成功构建缺失株STM-ΔSTnc1220,且具有良好的遗传稳定性；与SL1344亲本株相比，缺失株的生长速度、生化特性及生物被膜形成能力没有发生改变；在pH=4.8,pH=9和H_2O_2条件下生长速率差异不显著，但在4%NaCl环境下，缺失株在7 h后生长速率明显高于亲本株，在3.8%乙醇环境中缺失株在对数期的生长速率显著升高(P<0.05);其对巨噬细胞中黏附和侵袭能力极显著降低(P<0.01),小鼠LD_(50)显著升高，对小鼠的肝脏和脾脏的病理损伤致病力减弱。表明STnc1220基因在环境适应性和毒力调控中发挥了重要的作用。为阐明鼠伤寒沙门菌的致病机制提供理论依据。

【目的】构建鼠伤寒沙门菌BaeSR和AcrB双基因缺失株,探究BaeSR和AcrB对鼠伤寒沙门菌耐药性的影响。【方法】采用自杀质粒pLP12介导的同源重组系统构建鼠伤寒沙门菌标准株CR的AcrB基因缺失株CR△AcrB以及AcrB和BaeSR双基因缺失株CR△BaeSR△AcrB,比较分析鼠伤寒沙门菌缺失株与标准株对氨苄西林、阿莫西林、头孢噻呋、阿米卡星、安普霉素、四环素、强力霉素、阿奇霉素、恩诺沙星、环丙沙星、氟苯尼考、氯霉素12种药物的敏感性及生长特性、生物膜形成能力、运动性等生物学特性差异。【结果】成功构建了鼠伤寒沙门菌标准株CR的基因缺失株CR△AcrB和CR△BaeSR△AcrB。药物敏感性结果显示,与标准株CR相比,CR△AcrB对12种药物的MIC值均有不同程度的降低;与CR△AcrB相比,CR△BaeSR△AcrB对除青霉素类(氨苄西林和阿莫西林)以外的10种药物MIC下降了50%～87.5%。与标准株CR相比,CR△AcrB和CR△BaeSR△AcrB的生长速率无明显变化,但其生物膜形成能力(P<0.01)及运动性(P<0.05)均显著下降。【结论】鼠伤寒沙门菌AcrB和BaeSR基因缺失后,细菌的运动性及生物膜形成能力显著下降,对多种抗生素的敏感性增强。

细菌的Ⅲ型分泌系统(T3SS)与毒力密切相关。为探究鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和伴侣蛋白Hfq对T3SS相关基因spaP、invC、invG、prgH、prgI、prgJ、prgK的调控，利用Red同源重组技术构建了上述基因与lacZ的融合菌株，在此基础上利用P22噬菌体转导技术分别构建上述融合菌株与gcvB、hfq的单缺失菌株，通过qPCR和β-半乳糖苷酶试验分别检测gcvB、hfq缺失后各基因的转录水平和蛋白水平的变化。结果显示：与标准菌株相比，gcvB缺失后，spaP、invC、prgH、prgI、invG的转录水平和蛋白水平均上调；prgJ、prgK的转录水平上调，蛋白水平下调。hfq缺失后，spaP、invC、prgH、prgI、invG的转录水平和蛋白水平均上调，prgH、prgI、prgJ、prgK的蛋白水平下调。表明Hfq和GcvB均可对spaP、invC、invG、prgH、prgI、prgJ、prgK进行调控。上述结果可为鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和Hfq的作用机理研究提供参考。