【目的】研究建立一种高效制备从江香猪睾丸支持细胞（Sertoli cells，SCs）体外分离培养方法，为后续香猪雄性繁殖的科学研究提供细胞材料，为同类小型香猪支持细胞的分离培养提供参考。【方法】采用0.1% Ⅳ型胶原酶和0.25%胰酶-EDTA组合酶消化法消化睾丸组织，差速贴壁法纯化支持细胞，使用含10%胎牛血清完全培养基培养支持细胞，观察其形态特征并记录生长曲线，经苏木精-伊红（HE）染色、RT-PCR及免疫荧光染色进行支持细胞的鉴定。【结果】组合酶法消化后可获得大量生精上皮细胞混悬液，刚分离的支持细胞呈圆形或椭圆形，分离培养5～6 h后SCs贴壁，贴壁后细胞形态呈梭形或不规则形，培养3～4 d后细胞之间呈紧密连接，可清晰观察到细胞核及细胞质中的颗粒状物质或小空泡；SCs分离后1～2 d增殖速度缓慢，培养3～6 d细胞增殖速度加快，活性增强，进入对数生长期，培养7～8 d后细胞增殖速率下降，原代支持细胞生长曲线呈S形；HE染色显示SCs细胞核为深紫色，细胞质呈淡红色；RT-PCR结果显示支持细胞特异性基因WT1、SOX9均表达；免疫荧光染色结果显示特异性基因GATA-4抗体免疫阳性率达90%以上。【结论】成功建立从江香猪睾丸支持细胞的原代培养方法。

【目的】研究和田羊睾丸支持细胞的体外培养特性。【方法】取新生和田羊睾丸组织,利用两步酶消化后,采用差速贴壁法纯化细胞进行体外培养,并通过形态学观察、HE染色、AKP染色、油红O染色、吖啶橙染色、罗丹明123染色、免疫组化染色、RTPCR和MTT法检测细胞活性及纯度。【结果】培养基中加入2.00%血清浓度的DMEM/F-12可提高支持细胞纯度,在体外培养传至20代的和田羊睾丸支持细胞形态和核型均为正常;所培养的细胞内波形蛋白表达及标志基因SCF和GDNF的表达均为阳性。【结论】本试验成功建立了和田羊睾丸支持

为探究在体外培养过程中山羊睾丸支持细胞(GSCs)存在的氧化应激问题,采用2步酶消化法分离和纯化GSCs,通过形态学观察、MTT法、油红染色和流式细胞鉴定细胞活度和纯度,再用不同浓度的H2O2处理GSCs,研究GSCs的活性、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性及其DNA指数(DI)的变化。结果表明:GSCs形态为多角形状;在培养至第5天时GSCs活性最强;油红O染色鉴定多数细胞胞质含有红色的脂滴;GATA4阳性细胞率达到88.27±3.29%;添加50μmol/L H2O2组细胞存活率与对照组相比差异不显著(P>0.05),其它各组均显著低于对照组(P0.05),而其他各组均与对照组有显著差异(P

采用Ⅴ型胶原酶单次振荡消化法和低渗处理,及差速贴壁和免疫组化染色法,对大鼠睾丸支持细胞进行分离、纯化和鉴定。结果表明,该分离纯化方法对睾丸支持细胞损伤较小,获得的细胞活性较高,原代细胞存活率为85%,且无较大细胞团,接种后增殖迅速,并在第8天达到最高峰;细胞产率为6.5×105/g;绝大多数细胞呈F as-L阳性,细胞纯度可达95%;细胞核仁清楚,核仁周围可见着色较深的卫星核小体。

[目的]本试验旨在建立一个实时追踪山羊细胞自噬发生状况的工具,以探讨细胞自噬对睾丸支持细胞(SC)和生殖细胞的影响。[方法]通过PCR法扩增mCherry-EGFP-LC3基因序列1 884 bp,将其导入真核表达载体pEX-3中,得到重组质粒pmCherry-EGFP-LC3;将pmCherry-EGFP-LC3及对照质粒p EX-3分别转染体外分离培养的山羊SC,饥饿处理12 h后用荧光显微镜观察融合蛋白在细胞中的表达,用RT-qPCR和Western blot检测细胞中自噬相关基因和蛋白表达变化,用

【目的】确定FSH是否能调节支持细胞cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达及可能的机制。【方法】以培养的仔猪睾丸支持细胞为试验材料,通过添加各种信号通路的抑制剂,应用实时荧光定量PCR检测cyclinD1 mRNA和cyclin E1 mRNA的相对表达量。【结果】不同浓度的FSH(0—100 ng.mL-1)均可促进cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达(P

【目的】探寻一种简单的胰腺干细胞的分离方法,以便为糖尿病的细胞治疗研究提供丰富的种子细胞。【方法】采用胰酶消化法分离获得细胞,利用仅含有5%的血清的RPMI1640培养基培养细胞,低浓度的血清使得细胞大量死亡漂浮,只留下少数贴壁的小圆细胞。而后将血清浓度提高到15%以上继续培养;采用免疫组化方法对获得的细胞是否具有胰腺干细胞特征予以检测,并测定了细胞的生长曲线。【结果】在血清浓度提高后每个小圆细胞能快速增殖并形成一个克隆,经过这样增殖后的细胞可以连续传代,目前已传至60代。经免疫组化检测,细胞表达PDX-1、GLUT-2、vimentin等胰腺干细胞的标志;细胞也表达Glucagon、insu...

为了建立广西巴马小型猪附睾成纤维细胞体外培养体系,利用微量液体组织块贴壁法原代培养分离附睾成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏,并通过接触抑制和解除抑制研究细胞的增殖能力,以及通过免疫荧光对其进行鉴定。结果表明,该法成功分离获得广西巴马小型猪附睾成纤维细胞,并可以大量传代和冷冻,目前已经传至55代以上,生长良好;冷冻复苏和接触抑制解除后仍可以正常培养和传代;细胞免疫荧光检测,波形蛋白表达阳性。可见,通过微量液体组织块贴壁法能成功分离得到广西巴马小型猪附睾成纤维细胞,在体外能稳定培养和传代。

以原代分离培养仔猪睾丸支持细胞为模型,经含不同浓度(0、2.5、5、10、20、40、80、160μmol/L)乙酸棉酚或40μmol/L乙酸棉酚加800μmol/L的乙酰半胱氨酸(NAC)的培养基培养24 h后,检测细胞增殖率、细胞内活性氧(ROS)水平和丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性、培养基中乳酸脱氢酶(LDH)活性及细胞凋亡情况,研究棉酚对仔猪睾丸支持细胞的氧化应激及细胞凋亡的影响。结果显示:棉酚呈浓度依赖性抑制仔猪睾丸支持细胞增殖率,棉酚浓度大于等于10μmol/L时,细胞增殖率极显著降低;棉酚造成细胞内ROS水平显著升高、SOD活性显著降低、MDA含量升高及培养基中LDH活性升高;NAC显著抑制棉酚诱导的细胞内ROS水平升高、细胞增殖抑制及细胞凋亡。表明棉酚能诱导仔猪睾丸支持细胞凋亡,这可能与过量ROS生成而造成细胞氧化应激有关。

【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37℃、5%CO_2细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈"S"型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点(P<0.01)。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。

【目的】阐明产肠毒素大肠杆菌F18(ETEC F18)引发仔猪腹泻的机理,针对其候选基因FUT1的CDS区第307位点处的突变(G→A),建立3个仔猪小肠黏膜上皮细胞系(GG、GA和AA)。【方法】首先以胎鼠和仔猪为试验材料,确定小肠上皮细胞的最佳分离方法。采用XI型胶原酶和I型中性蛋白酶的联酶混合液,将胎鼠小肠组织机械剪碎后用联酶进行消化和直接将联酶灌注到仔猪小肠腔内消化的两种方法进行比较。针对仔猪小肠黏膜上皮细胞体外培养过程中成纤维细胞污染难以消除的问题,本研究采用局部画圈法逐步去除成纤维细胞。最后,用电镜和CK18免疫荧光染色对纯化后的原代仔猪小肠黏膜上皮细胞进行鉴定。【结果】两种小肠上...

从18日龄鸡胚长骨(股骨和胫骨)中机械分离破骨细胞于盖玻片和骨片上培养,以建立鸡胚破骨细胞体外培养方法。结合倒置相差显微镜、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、甲苯胺蓝染色及透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)对其形态和功能进行观察鉴定。结果表明,直接分离的细胞具有典型的破骨细胞的形态特点:属多核大细胞,TRAP染色阳性,能在骨片表面形成吸收陷窝。结论:鸡胚长骨机械分离法可获得一定数量并具有骨吸收活性的破骨细胞。

采用酶消化法和组织块法对小鼠、奶山羊、奶牛和家猪的表皮干细胞进行了分离、培养。结果表明:酶消化法适于小鼠表皮干细胞的分离,所获得的小鼠表皮干细胞在维持了两代之后自发分化为神经样细胞;奶山羊和奶牛不论用酶消化法还是组织块法都可以获得大量活力相对较好、表皮干细胞特性维持较久的细胞,奶山羊表皮细胞采用型胶原分选,用有血清培养液培养,经免疫细胞化学鉴定为表皮干细胞,可持续传至少9代,随着代数增高,细胞活力减弱。

在体外分离培养奶牛瘤胃上皮细胞,可为奶牛瘤胃生理功能和吸收机制研究和永生化奶牛瘤胃上皮细胞奠定基础。通过胰蛋白酶消化法从奶牛瘤胃组织中分离出瘤胃上皮细胞,并通过免疫细胞化学的方法检测细胞角蛋白,CCK-8检测细胞生长曲线,β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞的衰老以及细胞染色体核型分析来鉴定瘤胃上皮细胞。结果表明:1)利用胰蛋白酶消化法可以稳定的培养出瘤胃上皮细胞并且能够在体外传代大约5代;2)通过在显微镜下进行细胞形态的观察呈单层"岛屿状";3)在荧光显微镜下细胞角蛋白抗原能够发出绿色荧光;4)奶牛瘤胃上皮细胞传

为研究山羊小肠上皮细胞营养吸收调控及其与肠道微生物之间的关系,提供原代细胞培养模型,采用组织块接种来获得山羊小肠上皮细胞,利用有限稀释法来克隆山羊小肠上皮细胞,并通过细胞形态学以及细胞角蛋白18、波形蛋白、肌间线蛋白和细胞生长曲线来鉴定山羊小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块接种能够分离纯化得到山羊小肠上皮细胞并稳定传至大约10代;2)RT-PCR检测发现山羊小肠上皮细胞不能够表达波形蛋白和肌间线蛋白;3)在正置显微镜下观察到山羊小肠上皮细胞能够产生细胞角蛋白18绿色荧光。研究发现,培养至第8代的山羊小