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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
汪舒庆 葛向阳 陈正军
以干酪乳杆菌作为传递载体,构建表达人表皮生长因子的重组干酪乳杆菌,探讨原位表达特定蛋白的可行性。采用SOE PCR合成人表皮生长因子序列,克隆到干酪乳杆菌表达载体pELWH,构建pELWHhEGF重组质粒,将该质粒电转化干酪乳杆菌宿主,采用Western blot及间接免疫荧光检测目的蛋白的表达,并通过细胞增殖实验验证目的蛋白的生物学活性。结果表明:在重组菌的细胞表面及培养液上清中均检测到SlpA-hEGF融合蛋白,分子质量约55ku;细胞增殖实验显示SlpA-hEGF融合蛋白及干酪乳杆菌上清均能显著促进NIH/3T3细胞的增殖。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王保莉 吴方丽 张涌 郭蔼光
采用RT-PCR方法从人胎盘组织中扩增出hEGF基因,将其分别连入表达载体pGEX-4t-1(+)和pGEX-6p-1(+)质粒中,并转化入BL21-CodonplusTM中,解决了大肠杆菌密码子偏爱性问题,不需附加程序就可以编码稀有密码子的重组基因。SDS-PAGE结果证明,pGEX-4t-1(+)-hEGF和pGEX-6p-1(+)-hEGF分别在大肠杆菌BL21(DE3)-CodonplusTM-RP和BL21(DE3)-CodonplusTM-RIL中获得高效表达,目的蛋白占总菌体蛋白的30%左右。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
汪洋 杨桂香 吴波浪 张万江 黄伟华 彭险峰
【目的】猪表皮生长因子(pEGF)具有刺激静止期猪卵母细胞的成熟以及刺激仔猪胃肠上皮细胞成熟的功能,从而可以提高母猪繁殖率和降低断奶仔猪的应激。因此开发猪表皮生长因子具有重要意义。【方法】用人工合成的pEGF基因为模板,用PCR扩增获得pEGF-6His片段,将其克隆到载体pPIC9构建重组质粒pPIC9-pEGF并电转化毕赤酵母。用斑点杂交法筛选多拷贝整合转化子即基因工程菌,用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白,纯化产物用抗His-tag的单克隆抗体进行蛋白质免疫印迹、氨基端测序鉴定、体外生物活性检测。【结果】斑点杂交法筛选中信号越强的转化子,甲醇诱导表达的目的蛋白含量越高。免疫印迹中可以观...
[期刊] 华北农学报
[作者]
郭建军 袁林 曾静 邱小忠 付锦楠
以干酪乳杆菌为传递载体，以开发食品级安全的减蛋综合征病毒疫苗为目标，构建了一个温度敏感型自杀型质粒系统ｐ ＯＲＺｐ－ＵＫＤ。将该质粒电转化到干酪乳杆菌Ｌ．ｃａｓｅｉ中，经过２次升温处理和５－氟尿嘧啶抗性筛选，挑选阳性克隆，采用ｐｃＲ和ｓＤｓ－ｐａＧｅ方法进行鉴定。ＫｎＯｂｓ基因整合到干酪乳酸杆菌基因组内，并实现融合蛋白ＫｎＯｂｓ的分泌表达。表明得到了一株具有无任何选择性标记、携带有ＫｎＯｂｓ表达盒元件的基因组整合的重组干酪乳酸杆菌ＫｎＯｂｓΔＵｐｐ Ｌ．ｃａｓｅｉ，且整合的外源基因能够随着细菌的复制而进行表达，为减蛋综合征病毒免疫保护性抗原ＫｎＯｂｓ疫苗的进一步研制提供了试验数据。
[期刊] 水产学报
[作者]
朱文杰 黄桂菊 张东玲 范嗣刚 刘宝锁 毕晓敏 喻达辉
为探究表皮生长因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ｅｇｆ）在合浦珠母贝幼体发育以及组织生长过程中的作用，实验通过ｒａｃｅ技术克隆了合浦珠母贝ｅｇｆ－ｌｉｋｅ基因并做了相应的表达分析。实验结果获得ｃ ｄＮａ全长序列４ １０７ ｂｐ，命名为ｐｆ－ｅｇｆ１，开放阅读框（ｏｒｆ）７０２ ｂｐ，编码２３４个氨基酸，包含一个信号肽序列和一个跨膜结构域，功能结构域分析发现ｐｆ－ｅｇｆ１具有一个ｅｇｆ－ｌｉｋｅ结构域，有６个半胱氨酸残基，由３个二硫键维持，是表皮生长因子家族及其相关蛋白的特征结构域，但其余序列与现有相关基因序列差异较大，推测可能是一个新的ｅｇｆ－ｌｉｋｅ基因。表达结果显示，ｐ．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
朱文杰 黄桂菊 张东玲 范嗣刚 刘宝锁 毕晓敏 喻达辉
为探究表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)在合浦珠母贝幼体发育以及组织生长过程中的作用,实验通过RACE技术克隆了合浦珠母贝EGF-like基因并做了相应的表达分析。实验结果获得c DNA全长序列4 107 bp,命名为Pf-egf1,开放阅读框(ORF)702 bp,编码234个氨基酸,包含一个信号肽序列和一个跨膜结构域,功能结构域分析发现Pf-egf1具有一个EGF-like结构域,有6个半胱氨酸残基,由3个二硫键维持,是表皮生长因子家族及其相关蛋白的特征结构域,但其余序列与现有相关基因序列差异较大,推测可能是一个新的EGF-like基因。表达结果显示,P...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
刘敏 赵丽丽 葛俊伟 欧笛 王相清 刘弈 张伟 李一经
根据传染性胰腺坏死病毒(IPNV)VP3蛋白的全基因序列,设计并合成引物,以IPNV(ATCC VR-1318)细胞培养毒提取的核酸为模板,对传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的干酪乳杆菌表达系统进行了构建研究。结果显示:进行RT-PCR扩增得到截短的VP3基因约615 bp目的片段,将其克隆到pMD18-T Simple载体,经酶切、PCR扩增和序列测定后显示目的片段正确;将目的片段分别亚克隆到乳酸菌细胞表面表达型载体和分泌表达型载体,电转化于干酪乳杆菌,获得了阳性重组菌株。结果表明,通过本实验方法可构建表达传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的干酪乳杆菌表达系统,为实现IPNV VP3蛋白在乳酸菌中的表...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
徐义刚 崔丽春 葛俊伟 唐丽杰 赵丽丽 李一经
【目的】研究以干酪乳杆菌作为传递抗原活载体表达猪细小病毒主要免疫保护性抗原VP2蛋白的免疫特性。【方法】将构建的重组猪细小病毒(PPV)VP2基因的细胞表面表达型载体pPG-VP2电转化干酪乳杆菌L.casei393,获得阳性重组菌pPG-VP2/L.casei393。重组菌以2%乳糖为诱导物,在MRS培养基中进行诱导,经SDS-PAGE、Westernblot及间接免疫荧光分析,目的蛋白获得表达。将重组菌及空质粒菌株分别口服接种Balb/c小鼠,收集粪便及肠黏液样品测定小鼠产生抗VP2的特异性sIgA,采集血液样品测定小鼠产生抗VP2的特异性IgG,并对获得的抗体进行PPV中和活性的测定。【...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
周婷婷 王沥浩 王文慧 冯雪 杨晶
【目的】制备转人表皮生长因子(Human epidermal growth factor,hEGF)基因红花植株,为利用植物生物反应器规模化生产hEGF奠定基础。【方法】利用分子生物学方法将植物偏好的双基因hEGF克隆至表达载体pOP上,构建了重组质粒pOP-hEGF-hEGF,采用冻融法将质粒pOP-hEGF-hEGF转入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导方法转化红花,采用PCR检测、Southern blot筛选转基因红花阳性植株。【结果】成功构建了植物特异表达载体pOP-hEGF-hEGF,通过转化红花子叶,共获得了30株转基因红花植株,其中3株鉴定为阳性,转化率为10%;对转化植...
关键词：
人表皮生长因子 红花 遗传转化
[期刊] 中国水产科学
[作者]
郭豫杰 周开亚 马长艳
蜕皮抑制激素(molt-inhibitinghormone,MIH)属甲壳动物高血糖激素(crustaceanhyperglycemichormone,CHH)家族。MIH抑制Y 器官蜕皮激素的合成。以中华绒螯蟹(Eriocheirjaponicasinensis)眼柄总RNA为模板,根据中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Eriocheirjaponicasinensismolt inhibitinghormone 1,Ers MIH1)基因序列设计引物,用RT PCR的方法获得了Ers MIH1基因成熟肽的cDNA片段。序列分析表明,Ers MIH1基因成熟肽编码区含有228bp,编码75个氨基酸残...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王睿智 尹逊河 王慧 成子强
【目的】比较研究表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)基因的表达与青山羊皮肤毛囊发育之间的关系。【方法】用组织学技术和显微观测的方法,研究济宁青山羊1日龄、1—5月龄,共6个年龄段的皮肤毛囊的组织学特性,结合荧光定量PCR技术,研究其与EGF基因表达之间的关系,并用SAS9.0软件进行相关性分析。【结果】初级毛囊直径在出生后随日龄稍有增大,但差异不显著(P>0.05),而次级毛囊直径在2月龄之前极显著增大(P<0.01),达到发育高峰,之后保持相对稳定。EGF基因在出生后表达量极显著升高(P<0.01),在2月龄达到最高,之后表达量极显著减少(P<0.01)。【...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张劲 郭霭光 丰美福
β2微球蛋白(β2m)是主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ类分子的轻链部分,该蛋白的原核表达与纯化是制备MHC-Ⅰ类分子的首要条件。利用已经构建好的β2m原核表达载体pET 23a+β2m,在大肠杆菌(E.coli)中获得稳定表达。原核表达的β2m大部分在包涵体中,包涵体蛋白经充分洗涤、变性(尿素溶解)和复性,并以强阴离子交换柱层析(Q-Sepharose)纯化,获得SDS-PAGE纯的人重组β2m,W estern印迹法分析表明,该蛋白具有与抗人天然β2m抗体反应的特性。
关键词：
β2微球蛋白 重组蛋白 包涵体 复性
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
马世杰 李坤 付朋飞 郭晓庆 高晓云 崔保安 陈红英
【目的】构建能够稳定表达猪α-干扰素(IFN-α)成熟蛋白的重组干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei CECT5276),为将其作为口服疫苗来提高动物机体免疫力奠定基础。【方法】从质粒pMD18-IFN-α扩增出猪IFN-α成熟蛋白基因,再将其定向克隆到干酪乳酸杆菌整合型表达载体pMJ67的lac启动子下游,得到重组质粒pMJ67-IFN-α,电穿孔转化干酪乳酸杆菌。抽提干酪乳酸杆菌基因组DNA,进行PCR扩增及测序鉴定。采用半定量RTPCR检测猪IFN-αmRNA在干酪乳酸杆菌中的转录水平;采用Western blot对重组干酪乳酸杆菌菌体进行分析,检测其表达产物的活性;用双...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
戴珊 赵燕 刘芬 滕慧 张学文
以pET–30a和pEGX为出发载体，构建牛乳铁蛋白功能片段BlfFf基因工程表达的非融合性表达质粒pET–BlfFf和和融合性表达质粒pEGX–BlfFf，并在大肠杆菌BL21中诱导了蛋白表达。表达产物经SDS–PAGE分析，非融合型表达pET–BlfFf导表达的目标蛋白主要以包涵体形式存在，而融合型的pEGX–BlfFf表达的目标蛋白则可大量溶于细胞破碎上清液中，说明后者更适合表达可溶性目标蛋白。pEGX–BlfFf诱导表达产物经GST标签填料柱亲和层析纯化后，可制备出可溶性融合蛋白GST–BlfFf，其产量约为60 mg/L。该蛋白经凝血酶去除GST标签，获得纯化的目标肽BlfFf。对BlfFf的生物活性的试验表明，经过胃蛋白酶水解后的多肽对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抗菌活性。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
戴珊 赵燕 刘芬 滕慧 张学文
以pET–30a和pEGX为出发载体，构建牛乳铁蛋白功能片段BlfFf基因工程表达的非融合性表达质粒pET–BlfFf和和融合性表达质粒pEGX–BlfFf，并在大肠杆菌BL21中诱导了蛋白表达。表达产物经SDS–PAGE分析，非融合型表达pET–BlfFf导表达的目标蛋白主要以包涵体形式存在，而融合型的pEGX–BlfFf表达的目标蛋白则可大量溶于细胞破碎上清液中，说明后者更适合表达可溶性目标蛋白。pEGX–BlfFf诱导表达产物经GST标签填料柱亲和层析纯化后，可制备出可溶性融合蛋白GST–BlfFf，其产量约为60 mg/L。该蛋白经凝血酶去除GST标签，获得纯化的目标肽BlfFf。对BlfFf的生物活性的试验表明，经过胃蛋白酶水解后的多肽对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抗菌活性。
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